In diesem Video beschreiben wir ein labelfreies Live-Imaging-Protokoll zur Aufnahme von Bildern des Modellpilzes Aspergillus nidulans mit Hilfe von Durchlichtmikroskopietechniken. Wir verwenden diese Bilder, um die Wachstumskinetik von Aspergillus nidulans in flüssigen und festen Medien zu analysieren und zu quantifizieren. Eine visuelle Darstellung dieses Protokolls ermöglicht es benutzern, sich mit wichtigen Schritten der Bilderfassung und Mikroskopie-Bildverarbeitung vertraut zu machen.
Eine gängige Methode zur Messung des Fadenpilzwachstums sind zwei impfende Pilzsporen in einer Petrischale, die Nährstoffagar enthält, und einige Tage später den Durchmesser der sich entwickelnden Kolonie zu messen. Dieser Ansatz ist jedoch nicht sensibel genug, um feine Wachstumsunterschiede zu quantifizieren. Daher wurden Einzelzellmessungen mittels Zeitraffermikroskopie entwickelt.
Diese Messungen sind nicht nur in der Lage, genaue und quantitative Ergebnisse zu liefern, sondern auch die Wachstumsdynamik verschiedener Zellen innerhalb einer Population widerzuspiegeln. Darüber hinaus zielt dieser Ansatz darauf ab, die molekularen Mechanismen besser zu verstehen, die an Pilzwachstumsreaktionen auf endogene und Umweltsignale beteiligt sind. Beginnen Sie, indem Sie 15 Milliliter flüssiges Nährstoffagar in Petrischalen gießen.
Legen Sie den Deckel auf die Oberseite und lassen Sie ihn abkühlen. Verwenden Sie UV-Strahlung, um Platten zu sterilisieren. Bevor Sie die interessierende Pilzsorte aus einem Schaft herausstreifen, erhitzen Sie die Nickschleife im Bunsenbrenner, bis sie glühend heiß ist, kühlen Sie die Schlaufe, indem Sie sie in das Agar stechen.
Wirbeln Sie das Röhrchen und streifen Sie die Schleife über die Oberfläche des Agar-Minimalmediums, ergänzt mit den entsprechenden Ernährungsbedürfnissen. Inkubieren Sie Platten für zwei bis drei Tage bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie mit einem sterilen Zahnstocher eine kleine Anzahl von Konidien, indem Sie eine einzelne Kolonie sanft auf Platten mit vollständigen Medien berühren.
Inkubieren Sie die Platten drei bis vier Tage lang bei 37 Grad Celsius. Konidien von Aspergillus nidulans werden in einem sterilen 1,5-Milliliter-Wirbelrohr geerntet, wobei 1,0 Milliliter autoklaviertes Wasser mit 0,05% Volumen pro Volumen, Tween 80, zur Verringerung der Anzahl der Konidienklumpen enthalten. Eine modifizierte Version der invertierten Agarmethode wird zur Abbildung von filamentösen Pilzen auf der Oberfläche des Agarmediums verwendet.
Entdecken Sie zunächst 10 Mikroliter-Aliquoten von kräftig vortex konidialer Suspension, etwa zweimal 104 Zellen pro Milliliter auf Petrischalen von 15 Millilitern minimalem Medium mit einem Gewicht pro Volumen Agar. Inkubieren Sie die experimentelle Kultur entsprechend dem zu untersuchenden Entwicklungsstadium. Hier inkubieren wir drei Tage bei 30 Grad Celsius.
Danach schneiden Sie einen Agarblock, der die Kolonie enthält, mit einem sterilen Skalpell heraus. Hier schneiden wir einen Keil aus Agar am Kolonierand aus, kehren um und legen die Agarscheibe in eine acht, gut gleiten. Übertragen Sie 10 Mikroliter Aliquoten von kräftig vortex konidialer Suspension von etwa zwei mal 10 in der Stärke von vier in den Vertiefungen eines Bohrschiebers mit 200 Mikrolitern minimalem Medium mit den entsprechenden Ergänzungen.
Inkubieren Sie für die Zeit und Temperatur, die jedes Mal untersucht werden sollen. Die Wahl des Mikroskops hängt von der verfügbaren Ausrüstung ab. In jedem Fall sollte der Mikroskopaufstand eine umgekehrte Stufe, eine Umweltkammer oder zumindest einen Raum mit präziser Lufttemperaturregelung umfassen.
Heizen Sie zunächst den Thermostat und die Mikroskopkammer vor, um die gewünschte Temperatur zu stabilisieren. Hier stellen wir die Temperatur auf 30 Grad Celsius ein. Schalten Sie das Mikroskop, die Scannerleistung, die Laserleistung und den Computer ein und laden Sie die Bildgebungssoftware.
Legen Sie den zuvor vorbereiteten Gut-Objektträger in den Mikroskopstand und fokussieren Sie. Finden Sie Sichtfelder, die isolierte, nicht überlappende Zellen oder zumindest nicht überfüllt enthalten, um Wachstumsmessungen während der Bildanalyse zu erleichtern. Wählen Sie die zu verwendenden Durchlichtmikroskopietechnik aus und aktivieren Sie bei Bedarf den Durchlichtdetektor sowie Detektoren für Die Fluoreszenz.
Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass Bilder in den gewünschten Zeitintervallen erfasst werden, und starten Sie die Zeitreihenerfassung. Das Laden, Visualisieren und Verarbeiten von Bildern erfolgt mit der Open Source software imageJ Fiji. Beginnen Sie mit dem Import der Bilder nach Fidschi mit Plugins in einem Format.
Wählen Sie den Standardfarbmodus und die automatische Skalierung aus. Um einen Zeitstempel und eine Maßstabsleiste als Overlay zu visualisieren, gehen Sie zu Analyse, Tools, Skalierungsleiste. Legen Sie die gewünschten Parameter in Bezug auf Breite, Höhe, Farbe und Position der Skalierungsleiste fest.
Gehen Sie zu Bild, Eigenschaften, um Bildeigenschaften in imageJ Fiji Software anzuzeigen. Beobachten Sie frame-Intervallinformationen. Hier verwenden wir ein Zeitintervall von ca. 15 Minuten und drücken OKAY.
Gehen Sie dann zu Bild, Stapel, Beschriftung und legen Sie die richtigen Informationen auf Intervall fest. Legen Sie die Position der Beschriftung fest, indem Sie X und Y ändern.Legen Sie die Maßeinheit im Feldtext fest und drücken Sie die Vorschau. Verwenden Sie die Histogrammanpassung für die Beleuchtungskorrektur zwischen verschiedenen Frames, indem Sie Bild, Anpassung, Bleichkorrektur und Histogrammabgleich auswählen.
Ein neues Fenster mit korrigierter Beleuchtung erscheint. Verwenden Sie das MtrackJ-Plugin bei Plugins, MtrackJ, um wachsende Hyphenspitze zu verfolgen Um den Track hinzuzufügen, wählen Sie die Schaltfläche Hinzufügen in der Symbolleiste und platzieren Sie den ersten Punkt mit dem linken Mausklick auf der Hyphenspitze. Die Zeitreihe wird automatisch zum nächsten Frame verschoben.
Um den Tracking-Vorgang abzuschließen, doppelklicken Sie mit der Maus auf den letzten Punkt oder drücken Sie die Esc-Taste. Das Scrollen der Ausgabetabelle, der wichtigsten Spalte zur Berechnung des Hyphenspitzenwachstums, ist die Geschwindigkeit bei einem bestimmten Frame. Verfolgen Sie Messungen sicher, fügen Sie eine Datei hinzu, speichern Sie unter, in das Dateiformat Ihrer Wahl, z. B. CSV, importieren Sie die gespeicherte Datei in Ihr Tabellenkalkulationsprogramm und berechnen Sie die Visualisierung und weitere Tests.
Drücken Sie die Filmtaste, um einen Film vom RGB-Farbtyp zu generieren, der die Frames mit den darin gezeichneten Spuren enthält, die in jedem Standard-Multimedia-Player visualisiert werden können. Nach diesem Protokoll haben wir verschiedene Bilder aufgenommen und analysiert, die verschiedenen Wachstums- und Entwicklungsstadien des Fadenpilzes Aspergillus nidulans entsprechen. Die Abbildung zeigt den Vergleich von Wildtyp- und azhAD Delta ngnA Delta Wachstumsratenmessungen.
Der azhAD Delta ngnA Delta ist ein doppelt gelöschter Stamm in zwei Genen, der an der Entgiftung und Assimilation des toxischen Kampfmittels L beteiligt ist, wie es in zwei Carbonsäuren zugesetzt wird. Es zeigt statistisch signifikante Messungen mit niedrigerer Wachstumsrate im Vergleich zum Wildtypstamm in untergetauchten Flüssigkeitskulturen. Dieser Wachstumsunterschied ist nicht nachweisbar, wenn die Koloniefläche dieser beiden Stämme in festem minimalen Medium gemessen wird.
Einzelzellige Langzeit-Live-Bildgebung ist von erheblichem Wert bei der Gewinnung räumlicher und zeitlicher Informationen über die Dynamik zellulärer Proteine. Dieses Protokoll eignet sich auch für die Durchführung von Langzeit-Lebendzellbildgebung. Hier sehen wir die Keimung von Konidien, die das GFP-markierte eisosomale Kernprotein PilA und das mRFP-Histonen H1 co-exprimieren. Hier stellen wir ein Protokoll zur reproduzierbaren und zuverlässigen Analyse der Pilzwachstumskinetik vor, ohne dass eine vorherige Bildanalyseerfahrung des Benutzers erforderlich ist.
Dieses Protokoll ermöglicht eine objektive, genaue Quantifizierung des Pilzwachstums.
