Wir möchten Brandon Hassett und Carlos Ortiz für ihre technische Unterstützung zu danken. Diese Arbeit wurde von der NSF Zuschüsse IOB-0544428, 0951272-IOS, IOS-0925561 und an Dr. Michael Kolomiets unterstützt und von der USDA National Institute of Food and Agriculture (NIFA), Afri Pflanzenzüchtung und Bildung Grant # 2010-85117 -20539 bis Drs. Seth Murray, Thomas Isakeit, und Michael Kolomiets.

1. Maiskorn Bioassay <ol><li> Zwei Wochen vor, die Kultur pilzliche Erreger auf Kartoffeldextroseagar (PDA) bei 28 ° C </li><li> Wählen Kerne mit ähnlicher Größe und Form, vorzugsweise abgeflacht, so dass sie auf Höhe der Unterkante der Bioassay Fläschchen, und in 50 ml Falcon-Röhrchen zu legen. Kernel ausgewählt werden, müssen produziert worden sind gleichzeitig in derselben Umgebung, um ähnliche Samen Alters-und Metabolit-Zusammensetzung zu gewährleisten. </li><li> Oberfläche sterilisiert Kernel, die von Schüttelkolben bei Raumtemperatur für 5 Minuten mit 70% Ethanol, 1 Minute mit sterilem Wasser, und 10 Minuten mit 6% Natriumhypochlorit. Spülen, dreimal, jeweils 5 Minuten Zeit, mit sterilem Wasser dabei weiterhin zittern. Pat Kerne trocken auf autoklavierten Handtücher. </li><li> Um eine Infektion von Aspergillus flavus zu erleichtern, eine kleine Wunde auf den Embryo-Seite mit einer 18 G Nadel in die Tiefe von 0,5 cm. Aber nach unserer Erfahrung eine größere Wunde wird für Fusarium verticillioides Infektion benötigt. Therefore Verwenden einer Rasierklinge in den Embryo-Seite in einer Tiefe von 0,5 mm geschnitten. </li><li> Bereiten Inokulumsuspension durch Schaben kultivierten Platten in etwa 5 ml autoklavierten 0,01% Tween-20 Lösung, um Sporen zu befreien und zu entfernen Myzel durch die Schwerkraft Filterung durch mindestens 4 Schichten von autoklavierten Gaze. Berechnen Sie Sporenkonzentration mit Hämozytometer und justieren bis 10 6 Sporen / ml für A. flavus oder F. verticillioides. Bei Verwendung anderer Arten von Pathogenen oder einen Host, ist es wichtig, die Konzentration von Inokulum für geeignete Infektion zu bewerten. </li><li> Erstellen Sie eine feuchte Kammer in einem Plastikbehälter (29,2 cm x 18,7 cm x 8,3 cm) mit fünf Blatt Papier Handtücher und 100 ml sterilem Wasser gefüttert. Kammer ist nicht wasser-oder luft-und zusätzliches Wasser sollte in der gesamten Experiment zu halten feuchten Papiertüchern hinzugefügt werden. </li><li> Platz vier Kerne in einer autoklavierten 20 ml Glasszintillationsröhrchen und Aufzeichnung ihrer Masse. Impfen mit 200 ul Sporensuspension,Kappe und Wirbel gleichmäßig zu beschichten Kerne mit Federung. Lösen Sie sich frei Kappen ermöglichen den Luftaustausch und Ort in feuchten Kammer. </li></ol> Hinweis: Samen oder anderen Pilzen als die in dieser beschriebenen Verfahren, die Menge an Inokulum erforderlichen verschieden sein kann und sollte experimentell abgeleitet werden. <ol start="8"><li> Inkubieren Kernel unter einem 12-h-light/12-h-dark Photoperiode bei 28 ° C für 7 Tage oder bis die gewünschte. </li></ol> 2. Konidien Enumeration <ol><li> Nach der Infektion Zeitraum, 5 ml autoklavierten 0,01% Tween-20 in Szintillationsgefäße mit infizierten Körner und gründlich vortexen für 1 Minute. </li><li> Mit einer breit Bohrung Pipettenspitze, sofort durch die Übertragung von zwei getrennten 200 ul Aliquots Sporensuspension in 2,0 ml Eppendorf-Röhrchen mit 1,8 ml 0,01% Tween-20 (oder verdünnter als je nach Infektion erforderlich) zu verdünnen. </li><li> Zählen Sie jeweils 200 ul Aliquot zweimal mit einem Hämocytometer 4und vergleichen Ebenen der Konidien zwischen den Behandlungen. </li></ol> 3. Aflatoxin Quantifizierung <ol><li> Add-Kernel von 1 Probe zu 50 ml Mixbecher mit 20 ml 80% Methanol und 0,05 g NaCl, Deckel und Mischung bei hoher Geschwindigkeit für 1 min. </li><li> Setzen Sie ein Faltenfilter über eine saubere Sammlung Gefäss auf und füllen Extrakt in Filter. </li><li> Übertragen Sie 10 ml Filtrat in ein sauberes Gefäß, mit 20 ml destilliertem H 2 O, und gut mischen. </li><li> Filter Probe durch eine 1,5 um Glas-Mikrofaser-Filter in einen sauberen Becher. </li><li> Bewerben 1 ml filtrierte Extrakt zu Afla Spalte Test und mit Hilfe von Druckluft, zwingen das gefilterte Extrakt durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 1-2 Tropfen / Sekunde, bis entleert. </li><li> Waschkolonne zweimal mit 1 ml destilliertem H 2 O und durchlaufen Säule bei 1-2 Tropfen / Sekunde, bis Luft kommt durch. </li><li> Eluieren Säule mit 1 ml 100% HPLC-Qualität Methanol bei einer 1-2 Tropfen / Sekunde Geschwindigkeit in einen Glasküvette gesammelt. </li><li> Hinzufügen1 ml Afla Test-Entwickler auf Eluat und gut mischen. Ort Küvette in kalibriert Fluorometer und lesen bei 60 sek. </li></ol> Hinweis: Bei Verwendung des Aflatest FGIS Protokoll, die Messung aus dem Fluorometer wird basierend auf einer anfänglichen 50 g Probe in 100 ml extrahiert berechnet. Wenn Sie die Verdünnung der Probe mit Wasser betrachten, das 1 ml aufgetragen, um eine Spalte darstellt 0,166 g Probe. Also, bei einer Änderung des Protokolls, müssen Sie berücksichtigen die Unterschiede in der Stichprobengröße und die anfängliche Extraktionslösung. Zum Beispiel werden 2 g der Samen in 20 ml 80% Methanol extrahiert. Dies ist 0,1 g / ml. Wenn 1 ml dieser Probe werden mit 2 ml Wasser gemischt wird, ist der Anteil der Probe in der Flüssigkeit nun 0,033 g / ml. Wenn in diesem Beispiel gibt einen Fluorometer Lesung von 100 ppb, wird die tatsächliche Konzentration auf den Anteil der Probe 0,166, das heißt ppb = (0,166 g X 100 ppb) / 0,1 g), oder 166 ppb bezogen. Für alternative Aflatoxin QuantifizierungKation Methoden finden Sie unter Referenz 7. 4. Fumonisin B1 (FB1) Analyse <ol><li> Wenn Pilz auf Maiskörnern angebaut wird, zu extrahieren Proben über Nacht mit 10 ml Acetonitril / Wasser (50/50, v / v) bei Raumtemperatur ohne Schütteln. Anschließend mischen den Extrakt (2 ml) mit destilliertem Wasser (6 ml), und wenden Sie diese Mischung (8 ml) direkt mit dem C-18-Festphasenextraktion. </li><li> Vor dem Einlegen der Probe, die Voraussetzung C-18 Festphasenextraktionssäule durch Spülen mit 2 ml Acetonitril von 2 ml Wasser gefolgt. </li><li> Nach dem Laden der Probe wird die Säule mit 2 ml Wasser mit 2 ml Acetonitril / Wasser (15/85, v / v) gewaschen. Probe für die HPLC-Analyse (mit FB1) mit 2 ml Acetonitril / Wasser (70/30, v / v) eluiert. </li><li> Derivatisieren FB1 mit o-Phthalaldehyd (OPA) durch Übertragung von 0,1 ml Eluat der Säule in ein Fläschchen mit 0,1 ml Boratpuffer (0,05 M Borsäure acid/0.05 M Natriumborat [50/50, V / V], pH 8,5) und 0,1 OPA ml (0,1 mg / ml in Acetonitrile mit 0,5% - Mercaptoethanol). </li><li> Die Reaktion nach 10 min durch Zugabe von 0,5 ml acetonitrile/0.01 M Borsäure (40/60, v / v). </li><li> Analysieren FB1 auf einem Shimadzu HPLC LC-20AT-System mit einer analytischen Zorbax-ODS-Säule (4,6 150 mm) und einer variablen Wellenlänge Shimatzu RF-10Axl Fluoreszenzdetektor (Anregung 335 nm / Emission 440 nm) ausgestattet. </li><li> Ein linearer Gradient verwendet wird (Lösungsmittel A: acetonitrile/0.1 M Natriumphosphat (40/60), pH 3,3, Lösungsmittel B: Acetonitril / 0,1 M Natriumphosphat (60/40), pH 3,3) und die Gradienten-Programms ist wie folgt: 100% A bis 100% B in 10 min, 100% B für 5 Minuten. </li><li> Analysieren FB1 Standards mittels HPLC und Peakfläche Messungen werden verwendet, um Standardkurve zu erstellen. Anschließend quantifizieren FB1 Ebene in einer Probe durch Vergleich Peakflächen mit FB1 Standardkurve. </li></ol> 5. Ergosterol Analyse <ol><li> Kultur der Pilz auf Maiskörner für 7-14 Tage. </li><li> Nach der Inkubationszeit, fügen Sie 10 ml Chloroform: methnol (2:1, v / v) in jedem Fläschchen. Einmal aufgenommen, schütteln Sie die Proben gut und dann inkubieren Fläschchen im Dunkeln bei Raumtemperatur für 24 Stunden. </li><li> Nach 24 Stunden, die Proben zentrifugieren und den Überstand und filtern es durch 0,45 um Nylonmembran. </li><li> Die Probe direkt in ein Shimadzu HPLC LC-20AT-System mit einem 4,6 U ODS-C18-Säule (200 A, 250 ± 4,6 mm) und einem Shimadzu SPD-20A UV / VIS Detektor eingestellt bei 282 nm-Monitor ausgestattet. </li><li> Verwendung Methanol (100%) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml / min als mobile Phase. Bestimmen Quantifizierung von Ergosterol in Proben durch Vergleichen der Spitzenbereiche von Proben mit einer Standardkurve von HPLC-Qualität Ergosterol erzeugt. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Nach der Inokulation und die Inkubation in einer feuchten Kammer für zwei bis drei Tage, das Pilzwachstum zu beginnen, auf den Kernen zu sehen. Sieben Tage nach der Behandlung, das vegetative Wachstum auf behandelten Pflanzen sollten gut sichtbar sein, while Mock Kontrollen sollten nicht infiziert sind (Abbildung 1B, oben). Zeiträume von mehr Inkubation förderlich sind mehr reichlich vegetativen Wachstums (Abbildung 1B, unten). Unter den hier beschriebenen Bedingungen (Abbildung 2G), A. flavus Wildtyp-NRRL 3357 angezeigt Maximalwerte der Kolonisation, Aflatoxin Akkumulation, Produktion und Konidien bei 8, 6, und 8 Tage, (Abbildung 2, AC). Allerdings, wenn Mykotoxinkontamination und conidiation pro Einheit von Ergosterol verglichen wurden, wurden die größten Werte bei 4 und 6 Tage lang beobachtet, (Abbildung 2, DE). 2F fasst diese pilzliche Biomasse-abhängige maximale Wert-Beobachtungen. Interessanterweise zwischen 4-6 Tagen nach der Inokulation, unterzogen die Kerne Nukleinsäureabbaus, wie Gesamt-RNA von Proben auf den zeitlichen Verlauf (2H, unten) gesehen. Mehrere Studien, einschließlich unserer eigenen, haben ExaminEd F. verticilliodies Infektion auf Maiskörnern 2,8,9,10,11,12 und erfolgreich eingesetzt 7-13 Tage als Zeit-Punkte für Beobachtungen. Mit den hier beschriebenen Verfahren, Fumonisin liegen im Bereich von 3,500-8,000 ng / g und 4,13 Kernel Ergosterin liegen im Bereich von 5.000-10.000 ng / g Kernel 14,13. Abbildung 3 zeigt repräsentative Peaks für Fumonisin (oben) und Ergosterol (unten ) von HPLC-Chromatogrammen. Messung von Ergosterol kann auch über Absorptionsspektren 15 durchgeführt werden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ablaufschema für die Quantifizierung von pilzlichen Biomasse, Sporogenese und Mykotoxin-Produktion und repräsentative Ergebnisse für das vegetative Wachstum von Kernel-Bioassays. A) Flow-Diagramm, in der beschriebenen Methode zur Quantifizierung der grundlegenden biologischen Parameter verwendet werden, um die Pathogenität von Pilzen auf Maiskörnern zu beurteilen. B) VertreterErgebnisse für die Kernel-Bioassays. Top, A. flavus (NRRL3357) vegetatives Wachstum auf Maiskörnern in die B73 genetischen Hintergrund. Die Samen wurden mit 200 ul 10 6 Sporen / mL und Bilder aufgenommen wurden 7 Tage nach der Impfung geimpft. Unten, F. verticillioides inokulierten Körner in B73 Hintergrund 13 Tage nach der Infektion. Kerne wurden mit 200 ul 10 6 Sporen / ml inokuliert. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig2.jpg" /> Abbildung 2. Aspergillus flavus Kernel Bioassay zeitlichen Verlauf. B73 Kerne wurden mit 200 ul 10 6 Sporen / ml Aspergillus flavus Konidienaufschwemmung beimpft und für 2-8 Tage (G). (; Mittelwert ± SE n = 3-4) Alle Werte wurden aus dem Trockengewicht durchschnittlich 4 Kernel bestimmt. A) Die Kolonisation (bezogen auf Ergosterol), (B) Aflatoxin, und (C) wurden unter Verwendung conidiation oben beschriebenen Verfahren. E) und Aflatoxin (F) conidiation werden angezeigtin Abhängigkeit von pilzlicher Biomasse, wie durch h Ergosterol gemessen. F) Maximalwerte für Ergosterol, Aflatoxin Akkumulation und conidiation als Funktion der pilzlichen Biomasse - Maximalwerte für jede Menge beobachtet wurde auf 100% gesetzt. (H) 1 g pro Spur von Gesamt-RNA aus zeitlichen Verlauf. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig3.jpg" /> Abbildung 3. Vertreter High Performance Liquid Chromatographie (HPLC)-Chromatogramme für Fumonisin B1 (oben) und Ergosterol (unten) aus Kernen mit Fusarium verticillioides (M3125) infiziert isoliert.

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	<li>Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxylipins+as+developmental+and+host-fungal+communication+signals.">Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals.</a> Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).</li><li>Gao, X., Shim, W. -. B., G&#246;bel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+a+maize+9-lipoxygenase+results+in+increased+resistance+to+fungal+pathogens+and+reduced+levels+of+contamination+with+mycotoxin+fumonisin.">Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).</li><li>Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+oxylipin-mediated+cross-talk+in+the+Aspergillus+-+seed+pathosystem.">Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus - seed pathosystem.</a> Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).</li><li>Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., G&#246;bel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+lipoxygenase+ZmLOX3+increases+susceptibility+of+maize+to+Aspergillus+spp.">Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).</li><li>Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+lipids+and+oxylipins+are+crucial+signals+in+modulating+mycotoxin+production+by+fungi.">Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi.</a> Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).</li><li>Mukherjee, M., Kim, J. -. E., Park, Y. -. S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G+protein+signaling+in+F.+verticillioides+mediate+differential+host-pathogen+responses+on+non-viable+versus+viable+maize+kernels.">Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels.</a> Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).</li><li>Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+rapid+methods+for+the+analysis+of+mycotoxins.">A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins.</a> Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).</li><li>Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+Fusarium+moniliforme+within+asymptomatic+maize+kernels+and+kernels+associated+with+equine+leukoencephalomalacia.">Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia.</a> Plant Dis. 76, 144-148 (1992).</li><li>Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fumonisin+concentrations+in+kernels+of+transgenic+Bt+maize+hybrids+and+nontransgenic+hybrids.">Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids.</a> Plant Dis. 83, 130-138 (1999).</li><li>Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusarium+verticillioides+GAP!,+a+gene+encoding+a+putative+glycolipid-anchored+surface+protein,+participates+in+conidiation+and+cell+wall+structure+but+not+virulence.">Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence.</a> Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).</li><li>Shim, W. -. B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Fumonisin+B1+biosynthesis+in+maize+germ+and+degermed+kernels+by+Fusarium+verticillioides.">Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides.</a> J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).</li><li>Shim, W. -. B., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fumonisin+B1+biosynthesis+and+conidiation+in+Fusarium+verticillioides+by+a+cyclin-like+(C-type)+gene,+FCC1.">Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1.</a> Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).</li><li>Christensen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).</li><li>Shin, J. -. H., Shim, W. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+PPR1+and+PPR2,+genes+encoding+regulatory+subunits+of+protein+phosphatase+2A+in+Fusarium+verticillioides.">Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides.</a> Phytopathol. 99, S119 (2009).</li><li>Breivik, O. N., Owades, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Semimicrodetermination+of+Ergosterol+in+Yeast.">Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast.</a> Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Ich habe nichts zu offenbaren.</p

<p class="jove_content"&gt; Die hier beschriebenen Methoden wurden ausgiebig getestet und bewiesen, dass bei der Erzeugung von quantifizierbare Ergebnisse für Pilzbesiedlung, Sporogenese und Produktion von Mykotoxinen robust. Darüber hinaus sollte diese Methoden für Samen von anderen Pflanzenarten, die anfällig für Verunreinigung mit mycotoxigenic Pilze (zB Erdnüsse, Weizen, Baumwolle, Pistazien, etc.). Für kompetente Pflanze-Pathogen-Interaktion analysiert, ist es unerlässlich, dass die Samen am Leben gehalten werden. Eine kleine Wunde...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td></tr><tr><td> Kartoffeldextroseagar </td><td> Fisher Wissenschaftlicher </td><td> S71659A </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Wissenschaftlicher </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Plastic Container Inkubation </td><td> Sterilite </td><td> 1713LAB06 </td></tr><tr><td> Mixer </td><td> VICAM </td><td> 20200 </td></tr><tr><td> 24 cm Faltenfilter </td><td> VICAM </td><td> 31240 </td></tr><tr><td> 1,5 um Glasmikrofaser </td><td> VICAM </td><td> 31955 </td></tr><tr><td> Afla Spalte Test </td><td> VICAM </td><td> G1024 </td></tr><tr><td> Afrla Test-Entwickler </td><td> VICAM </td><td> 32010 </td></tr><tr><td> Methanol </td><td> VICAM </td><td> 35016 </td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> Fisher Wissenschaftlicher </td><td> AC14952-0025 </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Fisher Scientifc </td><td> AC39769-0025 </td></tr><tr><td> C-18 Festphasenextraktionssäule (Prep September SPE C18-Säule) </td><td> Fisher Wissenschaftlicher </td><td> 60108-304 </td></tr><tr><td> O-Phthalaldehyd (OPA) </td><td> Sigma Chemical Co. </td><td> 79760-5g </td></tr><tr><td> Borsäure </td><td> Fisher Wissenschaftlicher </td><td> BP168-500 </td></tr><tr><td> Natriumborat </td><td> Fisher Wissenschaftlicher </td><td> RDCS0330500 </td></tr><tr><td> Mercaptoethanol </td><td> Fisher Wissenschaftlicher </td><td> 45-000-231 </td></tr><tr><td> Shimadzu HPLC LC-20AT (Pumpe) </td><td> Shimadzu Scientific Instruments, Inc. </td><td> LC-20AT </td></tr><tr><td> Zorbax-ODS-Säule (4.6x150mm) </td><td> Agilent Technologies </td><td> 443905-902 </td></tr><tr><td> Shimatzu RF-10Axl Fluoreszenz-Detektor </td><td> Shimadzu Scientific Instruments, Inc. </td><td> RF-10AXL </td></tr><tr><td> Natriumphosphat </td><td> Fisher Wissenschaftlicher </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> FB1 Standards </td><td> Sigma Chemical Co. </td><td> F1147-1mg </td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> VWR </td><td> MK444410 </td></tr><tr><td> 13 mm Spritzenfilter mit 0,45 um Nylonmembran (HPLC) </td><td> Pall Life Science </td><td> 4426 </td></tr><tr><td> Ergosterol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 45480-50G-F </td></tr><tr><td> Szintillationsgefäße </td><td> VWR </td><td> 66021-602 </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> VICAM </td><td> G1124 </td></tr></tbody></table>

quantification of fungal colonization, sporogenesis, and production of mycotoxins using kernel bioassays

Die Verrottung der Körner durch Samen-Pilzresistenz stellt eine der größten wirtschaftlichen Herausforderungen zu Getreideproduktion weltweit, nicht zu ernsthaften Gefahren für die menschliche und tierische Gesundheit zu erwähnen. Unter Getreideproduktion ist Mais wohl die betroffenen Kultur, durch Pathogen-induzierte Verluste in Korn Integrität und Mykotoxin-Verunreinigung von Saatgut. Die beiden am weitesten verbreiteten und problematisch für Mykotoxine Maiserzeuger und Lebens-und Futtermittel-Prozessoren sind Aflatoxin und Fumonisin, durch Aspergillus flavus und Fusarium verticillioides produziert bzw.. Neuere Untersuchungen in der molekularen Pflanze-Pathogen-Interaktionen haben Versprechen für das Verständnis spezifischer Mechanismen mit pflanzlichen Reaktionen auf Pilzinfektion und Mykotoxinkontamination 1,2,3,4,5,6 verbunden demonstriert. Da viele Labs verwenden Kernel-Assays, um Pflanzen-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen, besteht ein Bedarf für ein standardisiertes Verfahren zur Quantifizierung von unterschiedlichen biologischen Parameter, soErgebnisse aus verschiedenen Laboratorien können Cross-interpretiert werden. Für eine robuste und reproduzierbare Mittel für quantitative Analysen auf Saatgut, haben wir im Labor Kernel-Assays und anschließender Methoden entwickelt, um das Pilzwachstum, Biomasse und Mykotoxinkontamination quantifizieren. Vier sterilisiert Maiskörner in Glasfläschchen mit einer Pilz-Suspension (10 6) beimpft und für einen vorbestimmten Zeitraum. Probenfläschchen werden dann für die Zählung von Conidien mit einem Hämocytometer, Ergosterin-Biomasse Analyse ausgewählt durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC), Aflatoxin Quantifizierung mit Hilfe eines AflaTest Fluorometer Verfahren und Fumonisin Quantifizierung durch HPLC.

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Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Die Verwüstung von Getreide durch Samen-Pilzresistenz hat zahlreiche Forschungsarbeiten zum besseren Verständnis Pflanze-Pathogen-Interaktionen dazu aufgefordert werden. Um Saatgut-Pilz-Interaktionen in einem Labor untersuchen, entwickelten wir eine robuste Methode zur Quantifizierung von Pilz-Reproduktion, Biomasse und Mykotoxinkontamination mit Kernel Bioassays.

Die Quantifizierung der Pilzbesiedlung, Sporogenese und Produktion von Mykotoxinen Kernel-Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

quantification-fungal-colonization-sporogenesis-production-mycotoxins

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.0K Aufrufe.  Texas A&M University. Die Verwüstung von Getreide durch Samen-Pilzresistenz hat zahlreiche Forschungsarbeiten zum besseren Verständnis Pflanze-Pathogen-Interaktionen dazu aufgefordert werden. Um Saatgut-Pilz-Interaktionen in einem Labor untersuchen, entwickelten wir eine robuste Methode zur Quantifizierung von Pilz-Reproduktion, Biomasse und Mykotoxinkontamination mit Kernel Bioassays.

Serie: Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

Colonization von Euprymna scolopes Squid durch Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Charakterisierung von Entzündungsreaktionen während der intranasalen Kolonisation mit Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

Einrichtung einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; System zur intrazelluläre Verhalten der Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Menschen THP-1-Makrophagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Einhaltung Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Beurteilung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Ein Mausmodell der Gruppe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse models of pulmonary fungal infection. Although multiple methods are used to assess fungal burden, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) of fungal DNA has emerged as a technique with several advantages over previous culture-based methods. Currently, a comprehensive assessment of lung pathology, leukocyte recruitment, fungal burden, and gene expression in mice with invasive aspergillosis (IA) necessitates the use of a significant number of experimental and control animals. Here the quantification of lung histological staining to determine fungal burden using a reduced number of animals was examined in detail. Lung sections were stained to identify fungal structures with Gomori&#39;s modified methanamine silver (GMS) staining. Images were taken from the GMS-stained sections from 4 discrete fields of each formalin-fixed paraffin-embedded lung. The GMS stained areas within each image were quantified using an image analysis program, and from this quantification, the mean percentage of stained area was determined for each sample. Using this strategy, eosinophil-deficient mice exhibited decreased fungal burden and disease with caspofungin therapy, while wild-type mice with IA did not improve with caspofungin. Similarly, fungal burden in mice lacking &#947;&#948; T cells were also improved by caspofungin, as measured by qPCR and GMS quantification. GMS quantification is therefore introduced as a method for the determination of relative lung fungal burden that may ultimately reduce the quantity of experimental animals required for comprehensive studies of invasive aspergillosis.

Here we describe a protocol to determine pulmonary fungal burden in mice with invasive aspergillosis by quantification of Gomori&#39;s modified methanamine silver staining in histological sections. Use of this method resulted in comparable results with less animals compared to assessment of fungal burden by quantitative PCR of lung fungal DNA.

Histologischen Quantifizierung Lunge Pilz Belastung in experimentellen Aspergillose bestimmen

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Echtzeit-Bildgebung und Quantifizierung der Pilz Biofilm-Entwicklung mit einem Zweiphasensystem rezirkulierenden Flow

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Methods Article

Die Quantifizierung der Pilzbesiedlung, Sporogenese und Produktion von Mykotoxinen Kernel-Bioassays