Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im biotechnologischen und biomedizinischen Bereich zu beantworten, wie z. B. was die molekulare Basis hinter den Warburg- und Crabtree-Effekten ist. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Studie mit hohem Durchsatz der Auswirkungen bestimmter Substanzen im Atem- und Fermentationsstoffwechsel ermöglicht. Beginnen Sie mit der Impfung einer 15-Milliliter-Konustube mit drei Millilitern kühlem, sterilem 2%Hefeextrakt Peptondextrose oder YPD-Brühe, mit 250 Mikrolitern S.cerevisiae Hefezellen, die in Glycerin bei negativen 20 Grad Celsius konserviert werden.
Inkubieren Sie die Hefe über Nacht in einem Orbital-Shaker bei 30 Grad Celsius und 200 Umdrehungen/Min.. zum Aufstreifen auf eine 60-Milliliter-, 2%YPD-Agar-gefüllte Petrischale am nächsten Morgen. Kultur das Gericht bei 30 Grad Celsius, bis isolierte Kolonien beobachtet werden.
Dann impfen Sie eine einzelne isolierte Kolonie in einer neuen konischen Röhre, die 10 Milliliter kühle, sterile 2%YPD-Brühe für DieNachtkultur bei 30 Grad Celsius mit Schütteln enthält. Für den Aufbau der Mikroplatte Wachstumskurve, fügen Sie 145 Mikroliter eines geeigneten experimentellen kulturellen Mediums zu jedem Brunnen einer sterilen 10-mal-10 Well-Mikroplatte mit deckel und impfen sie jeden Brunnen mit fünf Mikrolitern der Nachtkultur. Dann inkubieren Sie die Multi-Well-Platte in einem Mikroplattenleser bei 30 Grad Celsius mit konstanter Rührung bei 200 Umdrehungen pro Minute für 48 Stunden, wobei die optische Dichte bei 600 Nanometern alle 30 oder 60 Minuten gemessen wird.
Für geschüttelte Konzentrat-Wachstumskurven-Setup, impfen 20 Milliliter konische Kolben mit 4,8 Milliliter neines geeigneten sterilen Kulturmediummit 200 Mikroliter Vor-Inokulum-Kultur bei einer 600 Nanometer optischen Dichte von zwei für die Inkubation bei 30 Grad Celsius und 250 U/min. Agitation bei 250 Umdrehungen pro Minute ist entscheidend, um ein geeignetes Wachstum in niedrigen Konzentrationen von Kohlenstoffquellen zu erreichen, die Atemwachstum ausüben, da wir ein reduziertes Hefewachstum bei Atemwegserkrankungen bei niedrigeren Rührgeschwindigkeiten beobachtet haben. Um die Messung der optischen Dichte bei 600 Nanometern alle zwei Stunden für 24 Stunden zu ermöglichen, 100 Mikroliter der geschüttelten konischen Kolbenkultur in 900 Mikroliter destilliertem Wasser in einer Ein-Milliliter-Spektralphotometer-Küvette verdünnen und sanft per Pipette mischen.
Erstellen Sie für die Datenverarbeitung in einer geeigneten statistischen Paketsoftware eine neue Projektdatei, öffnen Sie das neue Tabellen- und Diagrammmenü, und wählen Sie XY aus. Wählen Sie im Beispieldatenmenü Start mit einer leeren Datentabelle und einem Punkt und Verbindungsliniendiagramm aus. Lassen Sie den X-Abschnitt in Unterspalten für Replikationen oder Fehlerwerte deaktiviert. Wählen Sie im Y-Abschnitt 10 Replikationswerte in nebeneinander-unterspalten und Plotmittelwert und Fehler-SD aus. Klicken Sie dann auf Erstellen.
Geben Sie den Zeitpunkt ein, zu dem die OD-Messungen in der X-Spalte erhalten wurden, und die OD-Werte, die aus den Kulturen in der Y-Spalte ermittelt wurden. Um die exponentielle Wachstumsphase zu identifizieren, in der die Y-Spaltendaten in Logarithmen umgewandelt werden, klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie die Transformationsanalyse aus. Verwenden Sie Y gleich Log Y, um die Y-Werte auszuwählen und den Ergebniskatalog zu öffnen.
Wählen Sie die Tabelle "Transformationsdaten", klicken Sie auf Analysieren, und wählen Sie die lineare Regressionsanalyse aus, ohne die optischen Dichtewerte, die keinem linearen Trend folgen, indem Sie die Werte in der Tabelle auswählen und das Steuerelement deprimieren und den Katalog für Datentabellen E.In, die Daten in einer Tabelle auswählen und auf Analysieren klicken. Wählen Sie die Analyse der nichtlinearen Regressionskurve und die zu analysierenden Datensätze aus, und klicken Sie auf OK. Wenden Sie dann die kleinsten Quadrate an, die auf die Daten passen, sodass der Interpolationsabschnitt deaktiviert bleibt, und klicken Sie auf OK. Öffnen Sie anschließend eine neue Projektdatei, und wählen Sie im neuen Tabellen- und Diagrammmenü die Spaltenauswahl aus, beginnen Sie mit einer leeren Datentabelle und dem gewünschten Diagramm. Legen Sie das Diagramm so fest, dass der Mittelwert mit der Standardabweichung dargestellt wird, und klicken Sie auf Erstellen.
Kopieren Sie die mittleren oder Deltazeitwerte aus der Tabelle der nichtlinearen Anpassungsergebnisse im Ergebniskatalog, und fügen Sie die Daten in eine Spalte ein. Klicken Sie schließlich auf Analysieren und wählen Sie die Analyse des Interesses im Menü "Spaltenanalysen" aus, um die kinetischen Parameter der verschiedenen nertrimentalen Bedingungen zu vergleichen. Die wachstumskinetischen Schwellenwerte variieren zwischen den Stärken und müssen entsprechend den Bedingungen bewertet werden, die wir in der Analyse verwenden.
Kulturen, die einen fermentativen Phänotyp zeigen, haben eine kleine Verzögerungsphase und eine exponentielle Phase mit einer hohen Wachstumsrate. Kulturen, die Energie hauptsächlich durch oxidative Phosphorylierung erhalten, weisen eine längere Verzögerungsphase mit einer langsamen Wachstumsrate während der exponentiellen Phase auf. Die Berechnung der spezifischen Wachstumsrate und die Verdoppelungder Zeit der Wachstumskurven unter Verwendung der exponentiellen Wachstumsgleichung ermöglicht die Festlegung von Schwellenwerten für die atmungseren und fermentativen Wachstumswerte.
Zum Beispiel, in diesen repräsentativen Experimenten, die Auswirkungen der verschiedenen Resveratrol Konzentrationen auf S.cerevisiae BY4742 Zellen zeigen die Veränderung der Zelle energetischen Status als Reaktion auf unterschiedliche Glukosekonzentrationen. Hier zeigt die Supplementierung mit 10%glukose, dass niedrigere Ammoniumkonzentrationen den fermentativen Stoffwechsel begünstigen, wie eine ausgedehnte exponentielle Wachstumsphase in diesen Kulturen zeigt, während eine höhere Konzentration einen respiro-fermentativen Stoffwechsel induziert, wie eine verlängerte Verzögerungsphase und eine langsamere Wachstumsrate während der exponentiellen Phase belegen. Schließlich können robuste Unterschiede bei den fermentativen Verdoppelungszeitwerten zwischen diesen beiden verschiedenen Hefestämmen beobachtet werden, die unter den gleichen Bedingungen angebaut werden, was die Notwendigkeit der Validierung des Verdoppelungszeitschwellenwerts für jeden analysierten Stamm unterstreicht.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass dieses Protokoll nur zum Abschirmen von Phänotyp verwendet wird. Die spezifischen Auswirkungen auf die Atmung und Fermentation müssen durch Sauerstoffverbrauchstests bzw. durch die Ansammlung von Fermentationsnebenprodukten bestätigt werden.
