Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es zeigt, wie polymere Nanopartikel, verkapselte Nukleinsäuren in einem einfachen Schritt hergestellt werden. Die Hauptvorteile dieser Technik sind die Vielseitigkeit, da sie auf verschiedene Nukleinsäuren und Zelltypen angewendet werden kann. Die Verwendung einfacher Verfahren zur Partikelvorbereitung, wie Pipettieren nach oben und unten, und die Möglichkeit, die Stabilität der Nanopartikel und Trommelbedingungen durch Lyophilisation zu verlängern.
Laura Olmo, Coral Garcia-Fernandez, Maria Stampa Lopez-Pinto und Maria Navalon-Lopez, Doktorandin unseres Labors und Marta Diaz-Caballero, Postdoktorandin für unser Labor, demonstrieren das Verfahren. Zur Bildung von Polyplexen die zuvor hergestellten Polymere, C6-Peptid, Poly-Beta-Aminoester aufgetaut und die Lösung gewirbelt. Nach dem Pipettieren der Polymermischung nach oben und unten eine 12,5 Millimolallösung in Natriumacetat herstellen.
Wirbeln Sie die Lösung und warten Sie 10 Minuten. Als nächstes bereiten Sie mRNA bei 0,5 Milligramm pro Milliliter vor und mischen Sie sie durch Pipettieren. Die Polymerlösung erneut vorwirbeln, dann die genetische Materiallösung in der Polymerlösung im Verhältnis eins zu eins in einem Mikrozentrifugenröhrchen mischen und das Röhrchen bei 25 Grad Celsius für 30 Minuten in einem Thermoblock inkubieren.
Nach der Inkubation wird die Mischung mit ein bis zwei RNase-freien Wassern ausgefällt, indem die Probe in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben wird, das das Wasser enthält, und dann, um die Hilfsstoffe einzuschließen, eine 20 Millimollar-Haufen und 4% Saccharoselösung im gleichen Volumen wie die Mischung aus mRNA- und Poly-Beta-Aminoestern hinzugefügt und durch Pipettieren gemischt werden. Für die Lyophilisation nach dem Einfrieren der Polyplexlösung bei minus 80 Grad Celsius für eine Stunde führen Sie die Primärtrocknung durch und lagern Sie die Polyplexe dann sofort bei minus 20 Grad Celsius, um eine Rehydratation zu vermeiden. Für die Polyplex-Resuspension entfernen Sie die lyophilisierten Nanopartikel aus dem minus 20 Grad Celsius gefrierenden Gefrierschrank und fügen Sie schnell die entsprechende Menge an tief hydriertem Wasser hinzu, um den Feststoff wieder zu dispergieren und die gewünschte Konzentration zu erreichen.
Sanft pipettieren, bis die vollständige Wiederverwendung erfolgt, und nach dem Auflösen kräftig auf und ab pipettieren, um Blasen zu vermeiden. Legen Sie nach 24 Stunden Transfektion zur qualitativen Beurteilung durch Fluoreszenzmikroskopie die 96-Well-Platte mit den transfizierten Hela-Zellen auf das Mikroskop und beginnen Sie mit der Visualisierung mit dem 10-fachen Objektiv. Wenden Sie zuerst einen Weißabgleich an, um eine Hintergrundreferenz für die Software zu erstellen, und erfassen Sie dann ein Bild, um es während der Analyse mit dem Fluoreszenzbild zu überlagern.
Ändern Sie den Mikroskopmodus in den Reflexionsmodus und bewegen Sie das Filterrad zum blauen Laser, um EGFP zu visualisieren. Nehmen Sie dann Bilder für alle Bedingungen oder Vertiefungen mit der gleichen Belichtungszeit auf. Für die quantitative Beurteilung mittels Durchflusszytometrie waschen Sie die hela-zellen, die in einer 96-Well-Platte transfiziert sind, mit 100 Mikrolitern PBS pro Well.
Nach dem Absaugen des PBS bei 25 Mikrolitern Trypsin pro Vertiefung und fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Sobald die Zellen abgelöst sind, fügen Sie das zuvor wiederhergestellte Medium hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren, und fixieren Sie dann die Zellen, indem Sie 31,25 Mikroliter 10% Formalin pro Vertiefung hinzufügen und 20 Minuten lang inkubieren. Schalten Sie als Nächstes das Durchflusszytometer und die Software ein und richten Sie dann die richtigen Bedingungen für das Experiment ein, einschließlich der Art des Plattenprobenvolumens und anderer Parameter wie Schütteln und Spülen zwischen den Proben.
Richten Sie die geeigneten Parameter ein, um den Prozentsatz der positiv transfizierten Zellen zu quantifizieren, indem Sie zuerst die Strömungsdaten auf vorwärts gestreutes Licht im Vergleich zu seitlichem Streulicht betrachten, um die Zellen von den Trümmern zu unterscheiden. Und dann ein weiteres Streudiagramm aufzeichnen, das die Amplitude im Vergleich zur Höhe vergleicht, um einzelne Zellen zu gateen und zu unterscheiden. Einen Tag vor der Transfektion, Platte 10.000 JAWS II-Zellen pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte für die Inkubation über Nacht.
Am nächsten Tag transfizieren Sie die Zellen mit 0,6 Mikrogramm mRNA pro Vertiefung und inkubieren die Platte für 24 Stunden in einem Trockenluftinkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Waschen Sie am nächsten Tag die im Brunnen verbleibenden Zellen mit 25 Mikrolitern PBS. Nach dem Absaugen des PBS bei 25 Mikrolitern Trypsin und inkubieren Sie die Platte für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius, um die Zellen zu lösen.
Stoppen Sie die Trypsin-Reaktion, indem Sie die zuvor wiederhergestellten Medien in den Korrespondentenbrunnen geben. Dann zentrifugieren Sie die Platte, saugen Sie das Medium ab und fixieren Sie die Zellen, indem Sie 50 Mikroliter PBS und 2,5% Formalin pro Vertiefung hinzufügen, gefolgt von der Inkubation der Platte bei vier Grad Celsius für 20 Minuten, zentrifugieren Sie die Platte. Dann fügen Sie 50 Mikroliter PBS und 3% BSA pro Vertiefung und Inkubator für 30 Minuten bei vier Grad Celsius hinzu.
Nach der Inkubation die Platte erneut zentrifugieren, dann 50 Mikroliter des Maus-Ovalbumin-Antikörpers in PBS und 3% BSA und Inkubator für 30 Minuten bei vier Grad Celsius geben. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und waschen Sie die Zellen mit 50 Mikrolitern PBS. Nach dem Absaugen des PBS die sekundären Antikörper hinzufügen und eine Stunde lang bei vier Grad Celsius inkubieren.
Wiederholen Sie nach der Inkubation die Zentrifugations- und Waschschritte. Dann resuspendieren Sie die Zellen und 100 Mikroliter PBS und 2,5% Formalin für die Durchflusszytometrie-Analyse. Die physikalisch-chemische Charakterisierung von frischen und lyophilisierten GFP-mRNA-verkapselnden Nanopartikeln zeigt keine signifikanten Unterschiede in Größe und Polydispergierindex.
Die Transmissionselektronenmikroskopie der Polyplexe bestätigt die Bildung von sphärischen und monodispersen Nanopartikeln mit einem Durchmesser von etwa 50 Nanometern. Verkapselungseffizienzdaten eines Lego-Peptids und modifizierter Poly-Beta-Aminoester-Polyplexe, die GFP oder Ovalbumin verkapseln, zeigen keine signifikanten Unterschiede je nach Art der mRNA. Eine qualitative Analyse der EGFP-Expression, 24 Stunden nach der Transaktion in der JAWS II-Zelllinie, ist hier dargestellt.
Quantitativ im Vergleich zur Negativkontrolle. Der Prozentsatz der GFP-positiven Zellen ist signifikant höher und vergleichbar mit einer Positivkontrolle, die mit einem klassischen Transfektionsreagenz durchgeführt wird. Das ovalbumin mRNA-beladene Oligopeptid und modifizierte Poly-Beta-Aminoester-Nanopartikel können dendritische Zellen aktivieren, wie die signifikant höhere Expression von CD11b- und CD86-Membranmarkern in transfizierten Zellen im Vergleich zu nicht-transfizierten Zellen zeigt.
Unsere Impfplattform, die auf der Verwendung von mRNA als Wirkstoff basiert, sowie unsere proprietären Polymere können sowohl für den Einsatz in der Prophylaxe als auch für Krebstherapeutika angepasst werden. Wir können unsere Technologie nutzen, um diesen Beitrag in Krebsimmuntherapeutika hervorzuheben. da wir tumorassoziierte Antigene in unseren Nanopartikeln verkapseln und eine Verschiebung in der Krebsbehandlung vornehmen können.
