Die Autoren möchten die teilweise Finanzierung aus dem Europäischen FP7 Forschungsprojekt NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) und dem INTERREG IV-France Schweiz NAOMI Projekt bestätigen.

1., Kultur und Erweiterung des menschlichen ESC <ol><li> Vorbereitung der Zellausbreitungsmedium (PM genannt), die Knockout DMEM, ergänzt mit 20% Knockout Serum, 1% MEM nicht-essentielle Aminosäuren, 1% L-Glutamin 200 mM, 1% Penicillin-Streptomycin und 3,5 ul β-Mercaptoethanol. </li><li> Auftauen menschlichen ESC (hES) in 8 ml PM-Medium und zentrifugieren 5 min bei 115 x g DMSO-Gefriermedium ergänzt verwerfen. </li><li> 1 ml der PM-Medium mit 10 mM Rock-Hemmstoff, um Apoptose zu verhindern und das Überleben der Zellen zu verbessern, auf dem Auftauen (nur 24 Stunden Inkubation). </li><li> Hinzufügen basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) mit dem PM in der gewünschten Konzentration (4-10 ng / ml) für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz. </li><li> Plate Die HES an bestrahlten menschlichen Vorhaut-Feeder-Zellen (γHFF) (Fig. 1A), die zuvor in einer Konzentration von 2 x 10 4 Zellen / cm 2 ausplattiert. </li><li> Medium täglich ändern und, falls erforderlich, Teile von c zu entfernenolonies beginnen zu differenzieren durch Aspiration mit einer länglichen scharf geschnittenen Pasteur Pipette. </li><li> Einmal in der Woche, Passage Kolonien enzymatisch: <ol><li> Medium entfernen und waschen Kolonien mit 2 ml PBS. </li><li> Entfernen PBS und inkubiert sie mit 0,5 ml pro Vertiefung von warmem Kollagenase IV auf 1 mg / ml für 10 min bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Sammeln Kolonie Fragmente in 2 ml neue PM und Zentrifuge bei 115 g für 3 min. </li></ol></li><li> Alternativ können Kolonien mechanisch durch Abkratzen agiert werden: <ol><li> Medium entfernen und waschen Kolonien mit 2 ml PBS. </li><li> Manuelles kratzen Kolonien mit der StemPro EZPassage Rollenschälgerät (Abbildung 1B). </li><li> Kolonie-Fragmente zu sammeln und zu zentrifugieren dann 3 min bei 115 · g, um den Überstand zu entfernen. </li><li> Plattenfragmente auf γHFF oder verarbeiten sie zur Differenzierung in Embryoidkörpern (EVG). </li></ol></li></ol> 2. Menschen ESC DifferenzierungProtokoll <ol><li> Bereiten Sie das Differenzierungsmedium (DM) mit Knockout DMEM mit 2% Hyclone Serum, 1,0% MEM Non-Essential Amino Acids, 1,0% L-Glutamin 200 mM, 1% Penicillin-Streptomycin, 3,5 ul β-Mercaptoethanol. </li><li> Medium entfernen und waschen Kolonien mit 2 ml PBS. </li><li> EB Bildung der Kolonie Fragmente in Suspension: <ol><li> Entfernen PBS und inkubiert sie mit 0,5 ml pro Vertiefung von warmem Kollagenase IV auf 1 mg / ml für 10 min bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Sammeln Kolonie Fragmente in 2 ml neuen DM und Zentrifuge bei 115 g für 3 min. </li><li> Kultur sie in Suspension in Ultra-Low-Befestigung 6-Well-Platten (2 ml pro Well) für 4 Tage (Abbildung 1C). </li><li> Sammeln und Platte die neu gebildeten EBs auf 0,1% Gelatine beschichtete 24-Well-Platten (ca. 3 EVG / well) (Abbildung 1D). </li></ol></li><li> Alternativ gezwungen Aggregation von Einzelzellen in EVG mit der Aggrewell Platte: <ol><li> PBS und entfernendistanzieren Kolonien in einzelne Zellen mit Accutase (0,5 ml / Vertiefung). </li><li> Zentrifuge und resuspendieren Zellen in DM auf 1,2 x 10 6 / ml. </li><li> 2 ml pro Aggrewell Kammer für 1 Tag (Abbildung 1B). </li><li> Sammeln neugebildeten EBs (Fig. 1C) und der Platte sie auf 0,1% Gelatine beschichteten 24-well-Platten (etwa 3 EBs / Vertiefung). </li><li> Ändern DM alle 2-3 Tage bis zum Erscheinen des Schlagens Cluster von Kardiomyozyten (15-30 Tage). </li></ol></li></ol> 3. Klima flüssigen 3D-Kulturen von Beating Cluster und Markierung mit HNPs <ol><li> Identifizieren und manuell sezieren Cluster schlagen Kardiomyozyten (1D), in der Regel nach 2-4 Wochen der Kultur erscheinen, mit einem länglichen scharf geschnittenen Pasteur Pipette. </li><li> Kaution 4 PTFE-Filter pro Einsatz, der auf einem 6-Well-Platte (Abb. 1F) gestellt werden. </li><li> 1 ml der DM Medium auf der Oberseite des each gut. </li><li> In einem seziert schlagen Cluster auf jedem PTFE-Filter (1E), maximale 4/well, dh 24 Aggregaten pro Platte (1F). </li><li> Ändern DM Medium alle 2-3 Tage. </li><li> Um die Cluster zu markieren, entfernen Sie die PTFE-Filter, der die Prügel-Cluster und legte es auf 3,5 cm Glasbodenschale (170 um dick). </li><li> 1 ml HNP in einer Konzentration von 50 ug / ml für 30 min. </li></ol> 4. Nichtlinearen optischen Imaging <ol><li> Probenvorbereitung. Nach HNP-Kennzeichnung (siehe Schritt 3.6), Transfer entweder ganz früh differenzier HeBS oder Herz-Schlagen-Cluster (bei Kontraktion Aussehen seziert) auf PTFE-Filter über einen 170 um dicke Glasbodenschale mit der Arbeitsabstand von hoher numerischer Apertur Zielen vereinbar. Alternativ tragen Sie eine Direktbeschichtung gegen Cluster auf die Glasbodenschale mit 0,1% Gelatine vor, beschichtet. </li><li> Über Proben einall-in-one-Mikroskop mit Inkubationskammer eine stabile Temperatur, Feuchtigkeit und CO 2-Regelung über längere Zeit ausgestattet. </li><li> Nach der ersten Inspektion, Bild der Probe über Weitfeld-Bildgebung unter Beleuchtung mit weißem Licht, um Strukturen von Interesse innerhalb differenzierten EBs oder aktive Schlagen Cluster, die für weitere Untersuchungen ausgewählt werden identifizieren. </li><li> Wenn die Zelle Autofluoreszenz von NADH und SH aus HNPs gleichzeitig erworben werden müssen, eine kürzere Laser-Anregungswellenlänge (zB 720 nm), um die molekulare Absorption entsprechen. Verwenden einen schmalen Bandpassfilter bei spektralen halben Anregungswellenlänge zentriert ist (dh λ = 360 ± 10 nm) bis SH erfassen, und eine weitere, um Autofluoreszenz zu detektieren. </li><li> Erstens eine schnelle, niedrige Auflösung, dreidimensionale Scan, um die Gesamt Morphologie des Herzcluster erneut, und wählen Sie eine Bildebene innerhalb der Cluster-Volume mit mehreren sichtbaren HNP durchführens. </li><li> Wenn nötig, ändern Sie die Anregungswellenlänge frei optischen Eigenschaften der Probe am besten entsprechen oder Photobleaching, Foto-Schäden und Bild tiefer in Gewebe mit einem IR-Wellenlänge (dh 790 nm) zu vermeiden und die zweite Harmonische Filter ersetzen entsprechend (dh 395 nm ). Optimierung der Einstellungen des Laserimpulses Vorverdichter bei der Arbeitswellenlänge der Wahl durch die Maximierung der zweiten harmonischen Signal der HNPs auf die Probe aufgebracht. </li><li> Um in Echtzeit überwachen die Herzkontraktionen Cluster, stellen Sie das Mikroskop optischen Scanner im schnellsten Modus wie Resonanzmodus, so dass mit hoher Geschwindigkeit Erwerb von zweidimensionalen Bildern. </li><li> Wählen Sie die Einstellungen als beste Kompromiss zwischen Bildkontrast und die Erfassungsgeschwindigkeit, wie etwa: <ul type="disc"><li> Scan Mittelung: 4 </li><li> Pixelverweilzeit: 0,1 Mikrosekunden </li><li> Bildrate: 3,75 Bilder pro Sekunde (fps) </li></ul></li><li> Laserleistung wird nach Brennfleck s eingestelltize-und Scan-Geschwindigkeit. 50 mW (gemessen am Eingang des Objektivs) ist ein typischer Wert für 0,1 us Pixelverweilzeit und Plan APO 20x NA 0,75 Ziel die Erhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen. </li></ol> 5. Bildanalyse <ol><li> Axial-Kalibrierung. Wählen Sie ein einzelnes HNP auf einer blanken Substrat abgeschieden. Die Scharfeinstellung (dh der axialen Position des Nanopartikels) zur Maximierung der Intensität SH. Variieren, in einer kontrollierten Art und Weise die axiale Position des Mikroskoptisches, um die Kalibrierungskurve, die SH-Intensität als Funktion der HNP erhalten von der Fokalebene versetzt sind. Der Ausgang dieses Kalibrierungsverfahren für den Plan APO 20X 0,75 NA Objektiv in 4C angegeben. </li><li> Wählen Sie in allen Video-Frames vorhanden HNPs und bestimmen deren periodische Bewegungen. Dieses Verfahren kann leicht automatisiert werden, zum Beispiel durch einen eigenen Code auf der Suche nach maximaler Intensität Signal-Spots in einem definierten Bereich von Interesse undunter verschiedenen Rahmen verbindet sie (ein Beispiel-Code in Matlab R2009 b mit Hilfe der Funktion &quot;Region Requisiten&quot; der Image Processing Toolbox geschrieben wird vorgelegt). </li><li> Bewerten Sie die Quantifizierung der Out-of-Plane-Verschiebungen, mit nicht-kontinuierlich nachvollziehbar HNPs sich entlang der optischen Achse, durch die Umwandlung ihrer Intensität Modulationen in ganz verschiedenen Rahmen in axiale Verschiebung anhand der Eichkurve in Schritt 5.1 fest verbunden. Beachten Sie, dass diese Prozedur ermöglicht den Zugriff auf axiale Bewegungen, aber nicht verwendet werden, um die absolute Richtung (nach oben oder unten) zu bestimmen. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Anwendung der Nanotechnologie zur Stammzellforschung ist ein relativ neues, aber rasch wachsenden Bereich. Wie durch verschiedene Übersichtsartikel zu diesem Thema erwähnt, kann die Verwendung von Nanopartikeln verwendet werden, um verschiedene Aufgaben zu erfüllen Forschung, die von Zellverfolgung (sowohl in vitro als auch in vivo), um die intrazelluläre Abgabe von Proteinen und Genen, nicht zuletzt die Schaffung biomimetische zellulären Umgebungen für Vorzugs Stimulation / Hemmung der spezifischen D...

Lineare Mikroskopiesysteme, die dank ihrer inhärenten dreidimensionalen Schneidefunktionen ausgelöst zunehmend die Nachfrage nach fotostabilen Fluorophore mit Zwei-Photonen-Absorptionsbanden im nahen Infrarot. Nur in den letzten paar Jahren, um die Entwicklung der Fluoreszenz-basierten Etiketten (Farbstoffe, Quantenpunkte Up-Converting-Nanopartikel), eine unterschiedliche bildgebende Methode ist die Verwendung einer neuen Familie von Natur aus nicht-linearen Nanopartikel als Etiketten zu nutzen, dh ergänzen Harmonische Nanopartikel (HNPs), die speziell für Multiphotonenmikroskopie entwickelt wurden. Diese Etiketten, basierend auf nicht-zentrosymmetrischen anorganischen Kristallen, ausüben optischen Kontrast Erzeugen des SH der Anregungsfrequenz: z. B. durch Umsetzen einer Fraktion von Nahinfrarot-Pulsanregungslicht (λ = 800 nm) in sichtbares blaues Licht (λ / 2 = 400 nm) . Mehrere Autoren in der jüngsten Vergangenheit haben verschiedene Materialien getestet, darunter Eisen Fe Jodat (IO <sub&gt; 3) 3 1, Kaliumniobat (KNbO 3) 2, Lithiumniobat (LiNbO 3) 3, Barium-Titanat (BaTiO 3) 4,5-, Kalium-Titanyl-Phosphat (KTiOPO &amp;sub4;, KTP) 6-8, und Zinkoxid (ZnO ) 5,9,10. Verglichen mit Fluoreszenzsonden, HNPs besitzen eine Reihe von attraktiven Eigenschaften, wie vollständiger Abwesenheit von Bleichen und blinkt, schmalen Emissionsbanden, Anregungswellenlängen-Abstimmbarkeit (von Ultraviolett bis Infrarot), Orientierung Gewinnungsfähigkeit und kohärente optische Antwort. Diese einzigartigen Eigenschaften wurden kürzlich in zwei umfassende Überprüfung Papiere 11,12 erklärt. Die Möglichkeit der Arbeit in den infraroten Spektralbereich, die Bildtiefe erhöht sich durch die Minimierung Streuung und Absorption, drastisch begrenzt Beispielfoto Abbau 13,14. Darüber hinaus ist die unendlich Foto-stabiles Signal von HNPs garantiert macht sie zu idealen Sonden für die langfristige Zellverfolgung, die ichist besonders attraktiv für die regenerative Medizin-Anwendungen 15. In diesem Experiment sichtbar gemacht werden Protokolldetails für in-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) mit nicht funktionalisierten HNPs Verfügung gestellt. Die Synthese und Herstellung von kolloidalen Suspensionen in einer früheren Veröffentlichung und die darin aufgeführten 16 und geht über den Umfang dieser Arbeit. Methoden zur Untersuchung von hESC Multi-Photonen-Mikroskopie und deren Differenzierung in Herz Cluster (als langfristige Klimaflüssigkulturen gepflegt) werden vorgestellt. Menschliche ESC lassen kann innerhalb sog. Embryoid Bodies (EBs) auf zwei verschiedenen Wegen, entweder durch EB Bildung von Kolonie-Fragmente in Suspension oder alternativ Zwangs Aggregation von einzelnen Zellen in EBs mit der Aggrewell Platte, wie in 1A dargestellt zu unterscheiden . Kultivierung schlagen Cluster von Herzzellen von Polytetrafluorethylen (PTFE), poröse Filter facilitates ihre langfristige Wartung für weitere Untersuchungen (z. B. elektrophysiologischen Messungen von Aktionspotentialen). Die Anregungsquelle des Rastermikroskops ist in der Lage, ultrakurze Pulse (mit einer Pulsdauer kleiner als 300 fs bei der Probe), um die Spitzenleistung benötigt, um zweite harmonische Bildgebung HNPs zuführen erreichen liefern. Zum Beispiel, die häufigste Quelle für fs-Bildgebung verwendet werden abstimmbaren Ti: Saphir-Laser. Alternativ können andere Ultrakurzpulslaser eingesetzt werden, beispielsweise mit Erbium-Ionen-17 Chrom Forsterit 18 oder Ti: Saphir-gepumpten optischen parametrischen Oszillatoren Infrarot. Das Mikroskop mit einem Objektiv mit vorzugsweise einem relativ hohen numerischen Apertur ausgestattet werden. Sehr wichtig ist, vor der Messung, und jedes Mal, wenn die Ziel ersetzt wird, ist es zwingend notwendig, in den Aufbau (Linsen), die die vorliegende Dispersion durch Optimieren der Einstellungen des Laserimpulses Vorverdichter an der Arbeits minimierenWellenlänge der Wahl. Dieses Verfahren, das in dem Protokoll beschrieben, stellt sicher, dass der Laserimpuls ist so nah wie möglich an der zu transformieren begrenzter Dauer (dh kürzesten wie möglich) in der Brennebene und maximiert die Probe nichtlinearen Antwort. Das Ziel des am Ende des Protokolls beschriebenen Bildanalyse ist die Identifizierung und Verfolgung in 3D HNPs Bewegungen mit den rhythmischen Kontraktionen des Herz schlagen Cluster verbunden. Tracking-Nanopartikel in der Bildebene wird einfach durch Ermittlung ihrer Positionen in aufeinanderfolgenden Filmrahmen realisiert. Informationen über eine axiale Bewegung zu extrahieren, ist eine vorherige Kalibrierung der Intensität nichtlinearen Antwort als eine Funktion der axialen Verschiebung zwingend. Beachten Sie, dass für Langzeitmessungen, eine aktive Steuerung der interferometrischen Probe axialen Position ist erforderlich, um die Gültigkeit der Kalibrierungskurve in Gegenwart von thermischen und / oder mechanischen Drifts zu halten. Die auf trac welche hier HNPse gegen Zellen innerhalb Aggregate werden auf Kaliumniobat Oxid (KNbO 3) auf, aber auch andere zur Verfügung nichtlineare Nanomaterialien sind im Detail in der Arbeit von Staedler et al 16 prüft. Die nichtlineare optische Effizienz der meisten der bisher untersuchten Nanomaterialien sind sehr vergleichbar. Die Wahl für KNbO 3 wurde im Wesentlichen durch die gute Stabilität der kolloidalen Lösung und ihre gute Biokompatibilität auf mehreren menschlichen Zelllinien auch bei ziemlich hohe Konzentration und lange Expositionszeiten 16 getestet motiviert. Angesichts der Neuartigkeit der für diese Arbeit eingesetzten Nanomaterialien werden die wichtigsten Merkmale der HNPs im Vergleich zu fluoreszierenden / lumineszierende Biomarker in einer kurzen ursprünglichen Computer-Videoanimation von den Autoren klar gezeigt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1008">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Microscope Incubator</td>
			<td style="width:231px;">OKO LAB</td>
			<td style="width:205px;">UNO package (top stage)</td>
			<td style="width:343px;">&#160;37&#176;C, 5% CO2, moisturized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="2" style="height:64px;width:231px;">Multiphoton microscope</td>
			<td rowspan="2" style="width:231px;">Nikon</td>
			<td rowspan="2" style="width:205px;">AR1-MP</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:343px;">Fast scanning, four non photomultiplier descanned detectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:231px;">Filters SHG and autofluorescence</td>
			<td rowspan="3" style="width:231px;">Semrock</td>
			<td style="width:205px;">FF01-360/12-25</td>
			<td rowspan="3" style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">FF01-395/11-25&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:205px;">FF02-485/20-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:231px;">Microscope objectives</td>
			<td rowspan="3" style="width:231px;">Nikon</td>
			<td style="width:205px;">CFI Plan Fluor 10x</td>
			<td style="width:343px;">NA 0.30, WD 16 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">CFI Plan Apo 20x</td>
			<td style="width:343px;">NA 0.75, WD 1.0 mm, VC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:205px;">CFI Apo 40x</td>
			<td style="width:343px;">NA 1.25, WD 0.18mm &#955;S, Nano-Crystal Coat</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Rhock inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">Y-27632</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">10829</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Knockout Serum&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">10828</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">MEM Non-Essential Amino Acids&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">1140</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">L-glutamine 200mM&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">25030</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">15140</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">M7522</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Collagenase IV&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:205px;">17104-019</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Roller scraper tool&#160;</td>
			<td style="width:231px;">StemPro EZPassage, Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">23181-010</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">StemPro Accutase&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:205px;">S11105-01</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Aggrewell system&#160;</td>
			<td style="width:231px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:205px;">27845</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Hyclone serum&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:205px;">SH30070.03</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Gelatin</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">G9391</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">6-well plates&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:205px;">353046</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">24-well plates&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Nunclon</td>
			<td style="width:205px;">142475</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters</td>
			<td style="width:231px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:205px;">NA76/25</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Inserts</td>
			<td style="width:231px;">Millipore</td>
			<td style="width:205px;">PICM03050</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harmonic nanoparticles for regenerative research

In diesem Experiment sichtbar gemacht werden Protokolldetails für in-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) mit zweiten Harmonischen Nanopartikel (HNPs) vorgesehen ist. Letztere sind eine neue Gruppe von Sonden kürzlich zur Markierung von biologischen Proben für Mehrphotonenabbildungs ​​eingeführt. HNPs der Lage sind, eine Verdoppelung der Frequenz der Anregungslicht durch die nichtlinearen optischen Prozeß der Erzeugung der zweiten Harmonischen, ohne Beschränkung auf die Anregungswellenlänge. Multi-Photonen-basierte Methoden für die hESC Differenzierung in Herz Cluster (als langfristige Klimaflüssigkulturen gepflegt) werden im Detail vorgestellt. Insbesondere ist Beweis, wie die intensive zweiten Harmonischen (SH) Emission von isolierten HNPs während der 3D-Überwachung von Herzgewebe zu schlagen in 3D gezeigt maximieren. Die Analyse der entstandenen Bilder, 3D-Verschiebungsmuster abzurufen ist auch beschrieben.

Vor der Bewertung der Schlagaktivität durch konfokale Bildgebung wurde eine sorgfältige Charakterisierung der nichtlinearen optischen Antwort der PTFE-Filter durchgeführt wird, entweder allein oder in Gegenwart von HNPs bei hoher Konzentration (1 mg / ml). Es wurde sichergestellt, dass: i) die blanke Substrat Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenz ist sehr schwach und kann nicht die Messung der relevanten biologischen Proben zu verhindern, und ii) das SH-Emission aus isolierten HNPs kann leicht durch Abbilden durch das...

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Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Protokolldaten werden für in vitro-Markierung humaner embryonaler Stammzellen, die mit der zweiten Harmonischen erzeugenden Nanopartikeln bereitgestellt. Methoden zur Untersuchung von hESC Multi-Photonen-Mikroskopie und deren Differenzierung in Herz Cluster werden ebenfalls vorgestellt.

Harmonic Nanopartikel für Regenerative Forschung

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.2K Aufrufe.  University of Geneva.  Protokolldaten werden für in vitro-Markierung humaner embryonaler Stammzellen, die mit der zweiten Harmonischen erzeugenden Nanopartikeln bereitgestellt. Methoden zur Untersuchung von hESC Multi-Photonen-Mikroskopie und deren Differenzierung in Herz Cluster werden ebenfalls vorgestellt. 

Serie: Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively for tissue regeneration, a number of variables must be taken into account. These variables include: the total volume and surface area of the implantation site, the mechanical properties of the tissue and the tissue microenvironment, which includes the amount of vascularization and the components of the extracellular matrix. Therefore, the materials being used to deliver these cells must be biocompatible with a defined chemical composition while maintaining a mechanical strength that mimics the host tissue. These materials must also be permeable to oxygen and nutrients to provide a favorable microenvironment for cells to attach and proliferate. Chitosan, a cationic polysaccharide with excellent biocompatibility, can be easily chemically modified and has a high affinity to bind with in vivo macromolecules4-5. Chitosan mimics the glycosaminoglycan portion of the extracellular matrix, enabling it to function as a substrate for cell adhesion, migration and proliferation. In this study we utilize chitosan in the form of microspheres to deliver adipose-derived stem cells (ASC) into a collagen based three-dimensional scaffold6. An ideal cell-to-microsphere ratio was determined with respect to incubation time and cell density to achieve maximum number of cells that could be loaded. Once ASC are seeded onto the chitosan microspheres (CSM), they are embedded in a collagen scaffold and can be maintained in culture for extended periods. In summary, this study provides a method to precisely deliver stem cells within a three dimensional biomaterial scaffold.

A major hurdle in current stem cell therapies is determining the most effective method to deliver these cells to host tissues. Here, we describe a chitosan-based delivery method that is efficient and simple in approach, while allowing adipose-derived stem cells to maintain their multipotency.

Der Bau einer Kollagen-Hydrogel für die Lieferung von Stem Cell-beladenen Chitosan-Mikrokügelchen

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

Forschung

Biotechnik

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Viral Nanopartikel für<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Biofunktionalisierten Prussian Blue Nanopartikel für Molekulare Bildgebung Multimodale Anwendungen

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

In these studies, we provide methodology for novel, neonatal, murine cardiac scaffolds for use in regenerative studies.

Neonatal Cardiac Scaffolds: Neuartige Matrices für Regenerative Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Herstellung von Metallnanopartikeln durch gepulste Laserablation in Flüssigkeiten: Ein Werkzeug zum Studium der antibakteriellen Eigenschaften von Nanopartikeln

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

20 mJ, 1 ps Yb:YAG Thin-disk Regenerative Amplifier

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with turn-key performance and microjoule-level pulse energy is used to seed the regenerative chirped-pulse amplifier. The amplifier is placed in airtight housing. It operates at room temperature and exhibits stable operation at a 5 kHz repetition rate, with a pulse-to-pulse stability less than 1%. By employing a 1.5 mm-thick beta barium borate crystal, the frequency of the laser output is doubled to 515 nm, with an average power of 70 W, which corresponds to an optical-to-optical efficiency of 70%. This superior performance makes the system an attractive pump source for optical parametric chirped-pulse amplifiers in the near-infrared and mid-infrared spectral range. Combining the turn-key performance and the superior stability of the regenerative amplifier, the system facilitates the generation of a broadband, CEP-stable seed. Providing the seed and pump of the optical parametric chirped-pulse amplification (OPCPA) from one laser source eliminates the demand of active temporal synchronization between these pulses. This work presents a detailed guide to set up and operate a Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier, based on chirped-pulse amplification (CPA), as a pump source for an optical parametric chirped-pulse amplifier.

A protocol for the operation of a high-energy, high-power optical parametric chirped pulse amplifier pump source based on an Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier is presented here.

20 mJ, 1 ps Yb: YAG Dünnschicht-Regenerationsverstärker

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

3D Microtissues für injizierbare Regenerative Therapie und Hochdurchsatz-Drogen-Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation purposes. The process to generate such tissues is complex, and includes an appropriate combination of specific cell types, scaffolds, and physical or biochemical stimuli to guide cell growth and differentiation. Microcarriers represent an appealing tool to expand cells in a three-dimensional (3D) microenvironment, since they provide higher surface-to volume ratios and mimic more closely the in vivo situation compared to traditional two-dimensional methods. The vascular system, supplying oxygen and nutrients to the cells and ensuring waste removal, constitutes an important building block when generating engineered tissues. In fact, most constructs fail after being implanted due to lacking vascular support. In this study, we present a protocol for endothelial cell expansion on recombinant collagen-based microcarriers under dynamic conditions in spinner flask and bioreactors, and we explain how to determine in this setting cell viability and functionality. In addition, we propose a method for cell delivery for vascularization purposes without additional detachment steps necessary. Furthermore, we provide a strategy to evaluate the cell vascularization potential in a perfusion bioreactor on a decellularized&#160;biological matrix. We believe that the use of the presented methods could lead to the development of new cell-based therapies for a large range of tissue engineering applications in the clinical practice.

We propose a cell expansion protocol on macroporous microcarriers and their use as delivery system in a perfusion bioreactor to seed a decellularized tissue matrix. We also include different techniques to determine cell proliferation and viability of cells cultured on microcarriers. Furthermore, we demonstrate functionality of cells after bioreactor cultures.