Dieses Protokoll zeigt die geeignete Methodik für das Schneiden und Färben von Herz- und Hirngewebe. Es enthält auch Richtlinien für die Einrichtung von Beleuchtungs- und Kameraeinstellungen sowie Fototechniken für die Bildaufnahme. Diese Methoden sind besonders nützlich für die Durchführung von Messungen in der planimetrischen Bildanalyse in Nagetiergeweben und können für die allgemeine wissenschaftliche Makrofotografie von Wert sein.
Lösen Sie zunächst die Herzkanüle von der Spritze, die mit Krebs-Henseleit-Lösung gefüllt und mit einer Spritze verbunden ist, die mit einer warmen Krebs-Henseleit-Lösung gefüllt ist, die 0,1% Methylenblau enthält. Durchbluten Sie das Rattenherz mit vier Millilitern der Methylenblaulösung mit einer Rate von vier Millilitern pro Minute. Nachdem Sie die Kanüle von der Spritze getrennt und das Herz von der Kanüle entfernt haben, entfernen Sie das überschüssige Methylenblau, indem Sie das Herz vorsichtig auf Seidenpapier rollen.
Nachdem Sie das überschüssige Methylenblau entfernt haben, lösen Sie die Ligatur um die Koronararterie, indem Sie die hämostatische Pinzette öffnen und den Kunststoffschlauch um die chirurgische Naht entfernen. Als nächstes legen Sie das gefärbte Rattenherz zum Schneiden in eine Edelstahlmatrix. Schneiden Sie die Ventrikel in zwei Millimeter dicke Scheiben und zielen Sie auf sechs bis sieben Scheiben von einem erwachsenen Rattenherz ab.
Nach dem Schneiden die Scheiben in ein 15-Milliliter-Kunststoffrohr geben. Dann fügen Sie fünf Milliliter 1% Triphenyltetrazoliumchlorid, gelöst in PBS, in das Röhrchen mit den Herzscheiben und inkubieren Sie für 10 Minuten in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius mit sanftem Mischen nach fünf Minuten. Nach der Inkubation die Herzscheiben mindestens zwei- bis dreimal mit PBS waschen und für die Bildaufnahme vorbereiten.
Nachdem Sie das Gehirn, einschließlich des Hirnstamms, aus dem Schädel entfernt haben, platzieren Sie das Gehirn mit seiner ventralen Seite nach oben in der Gehirnmatrix. Wählen Sie je nach Gewicht der Tiere die richtige Größe der Gehirn-Edelstahlmatrix. Verwenden Sie Klingen, beschränken Sie die frontalen und kaudalen Teile des Gehirns.
Legen Sie dann die Klingen teilweise in die Kanäle zwischen der ersten und der letzten Klinge. Wenn alle Klingen parallel eingeführt und angeordnet sind, drücken Sie alle Klingen gleichzeitig mit der Handfläche nach unten, um das Gehirn in zwei Millimeter koronale Scheiben zu schneiden. Greifen Sie dann die Klingen mit zwei Fingern fest an den Seiten entlang und entfernen Sie sie zusammen mit dem geschnittenen Gehirn aus der Matrix.
Ordnen Sie die Gehirnscheiben nacheinander in einem Tablett an und stellen Sie sicher, dass die innere Oberfläche jeder Scheibe immer nach oben zeigt. Als nächstes gießen Sie warme 1% Triphenyltetrazoliumchloridlösung und PBS auf die Gehirnscheiben und inkubieren Sie acht Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Dunkeln. Übertragen Sie die Gehirnscheiben nach der Inkubation in eine blaue Plastikschale, um Bilder aufzunehmen.
Ordnen Sie die Gehirnscheiben in sequenzieller Reihenfolge vom frontalen zum kaudalen Teil an und verwenden Sie ein Skalpell, um die Hemisphären in der Sagittalebene zu trennen. Fotografieren Sie die Gewebescheiben unmittelbar nach dem Färben. Richten Sie die Kamera Ihrer Wahl mit einem aufgeladenen Akku, einer Speicherkarte und einem angeschlossenen Objektiv auf einem Ständer ein.
Wählen Sie je nach verfügbaren Lichtquellen die entsprechenden Weißabgleichseinstellungen aus oder führen Sie eine Farbtemperaturkalibrierung gemäß den Anweisungen im Kamerahandbuch durch. Tauchen Sie die Herzscheiben vollständig in einen Behälter mit PBS. Ordnen Sie die Gehirnscheiben in einem trockenen Tablett ohne PBS oder andere Flüssigkeiten an.
Platzieren Sie den Behälter mit Slices unter der Kamera mit dem Makroobjektiv. Stellen Sie sicher, dass alle Slices vollständig in das Sichtfeld passen und sich auf derselben Ebene befinden. Schalten Sie die Kamera in den vollständig manuellen Modus, stellen Sie die ISO 100 und die Blende auf F10 ein.
Stellen Sie die Verschlusszeit für eine optimale Bildbelichtung ein und stellen Sie sicher, dass die Kamerabrennebene parallel zu der Oberfläche verläuft, auf der sich die Probe befindet. Nachdem Sie die Probennummer erfasst haben, drehen Sie den zirkularpolarisierenden Filter, bis die Reflexionen verschwinden, und stellen Sie die Gewebescheibe mit einem Fernauslöser ab, um ein Verwackeln der Kamera zu verhindern, wenn der Auslöser losgelassen wird, drehen Sie dann die Scheiben und nehmen Sie Bilder von der anderen Seite auf. Dieses Foto einer mit Methylenblau und Triphenyltetrazoliumchlorid gefärbten Herzscheibe nach einem Myokardinfarkt enthält genügend Details und Farbinformationen für eine weitere planimetrische Analyse der Infarktgröße.
Das Einfrieren von Herzgewebe für 24 Stunden beeinträchtigt die Integrität und reduziert die mitochondriale Funktion. So ist die Triphenyltetrazoliumchlorid-Färbung des Herzens nicht rot, sondern blassrosa, und die Grenze zwischen dem nekrotischen und dem lebensfähigen Gewebe ist verschwommen. Von den beiden verglichenen Methoden zur Reduzierung von Reflexionen in den Proben ist die Immersion die effizienteste Methode und erzeugt detaillierte Bilder mit gutem Kontrast.
Der Polarisationsfilter ist ebenfalls wirksam, reduziert jedoch leicht die Auflösung und den Mikrokontrast des Bildes. Ein Bild einer Herzscheibe ohne Eintauchen oder Filter enthält viele Reflexionen und ist nicht für eine weitere Analyse geeignet. Bei der planimetrischen Analyse sollte die nicht betroffene Seite des Gehirns mit der vom Schlaganfall betroffenen Seite verglichen werden.
Manuelle Kameraeinstellungen sorgen für eine optimale Belichtung und einen optimalen Weißabgleich aller Bilder und ermöglichen eine gleichmäßige Analyse. Beispiele für über- und unterbelichtete Bilder von Herzschnitten werden hier gezeigt. Darüber hinaus führen falsche Weißabgleicheinstellungen zu einer Verschiebung auf Blau oder Gelb und Magenta oder Grün im Bild.
Wissenschaftliche Makrofotografie erfordert eine kontrollierte Beleuchtung und einen geeigneten Bildaufbau. Die standardisierte Methodik gewährleistet qualitativ hochwertige, detaillierte digitale Bilder. Diese Methode ist auf alle experimentellen Kleintierorganfotografien anwendbar.
