Die beiden hier demonstrierten Peeling-Techniken isolieren einzelne subzelluläre Stäbchenkompartimente und können dazu beitragen, die wichtigen physiologischen Prozesse aufzudecken, die in jedem spezialisierten Kompartiment bei gesunden und kranken Stäbchen ablaufen. Die Isolierung verschiedener Stäbchenzellkompartimente von der Netzhaut der Maus kann eine Herausforderung darstellen. Diese einfachen Techniken verwenden kostengünstige und alltägliche Labormaterialien, um subzelluläre Kompartimente für die Proteinanalyse zuverlässig zu isolieren.
Legen Sie zunächst ein Stück Filterpapier in eine Petrischale, die mit Ames HEPES-Puffer gefüllt ist, der mit 100% Sauerstoff gefüllt ist. Übertragen Sie dann mit einer Breitrohr-Transferpipette ein retinales Rechteck, das von einer zwei bis drei Monate alten C57 Black 6J-Maus seziert wurde. Richten Sie die unterteilte Netzhaut konkav aus und stellen Sie sicher, dass die Photorezeptoren nach unten zum Boden der Schale zeigen.
Greifen Sie dann mit einer Pinzette leicht die Seiten der halbierten Netzhaut und bewegen Sie sie auf das Filterpapier. Sobald die Netzhaut zentriert ist, bewegen Sie das Filterpapier nach oben, so dass die halbierte Netzhaut das Filterpapier berührt, um ein äußeres Segment zu erzeugen, oder ROS, um die Papierhaftung zu filtern. Heben Sie das Filterpapier mit der angebrachten Netzhaut vorsichtig aus dem Ames HEPES-Puffer heraus.
Legen Sie die Unterseite des Filterpapiers auf ein Papiertuch und tupfen Sie zwei- bis dreimal zum Trocknen ab. Fügen Sie einen Tropfen Ames HEPES mit der Netzhaut auf die Seite des Filterpapiers und legen Sie das Filterpapier zum Trocknen erneut auf das Papiertuch. Als nächstes legen Sie das Filterpapier mit der Netzhaut zurück in die Petrischale und drücken Sie mit einer Pinzette vorsichtig alle Ränder der halbierten Netzhaut nach oben und weg vom Filterpapier auf allen Seiten.
Ziehen Sie die Netzhaut vorsichtig vom Filterpapier weg und berühren Sie nur den äußersten Umfang der Netzhaut, um ihre strukturelle Integrität zu erhalten. Heben Sie dann das Filterpapier aus der Petrischale und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit auf einem Papiertuch, um sicherzustellen, dass die Seite, die mit der Netzhaut in Kontakt kommt, das Papiertuch nicht berührt. Legen Sie das Filterpapier mit der partiellen ROS-Schicht in ein markiertes Rohr auf Eis und halten Sie die geschälte Netzhaut in den Ames HEPES-Puffer getaucht.
Wiederholen Sie den Peeling-Vorgang für diese halbierte Netzhaut etwa sieben bis acht Mal, um die gesamte ROS-Schicht zu entfernen. Legen Sie das Filterpapier nach jedem Abziehen in dasselbe Röhrchen, um alle ROS zu kombinieren, die von einer halbierten Netzhaut isoliert sind. Bewahren Sie das Rohr mit allen Filterpapierschalen des isolierten ROS zur sofortigen Verwendung auf Eis auf.
Übertragen Sie die übrig gebliebene geschälte Netzhaut mit einer Pinzette in eine entsprechend gekennzeichnete Röhre und halten Sie die Tube zur sofortigen Verwendung auf Eis. Um die Netzhautprobe für die Lyophilisation vorzubereiten, legen Sie ein Stück Filterpapier und geben Sie eine halbierte Netzhaut in eine Petrischale, die mit kaltem Ringerpuffer gefüllt ist. Als nächstes drehen Sie die Netzhaut mit einer Pinzette vorsichtig um, so dass sie konkav nach oben ausgerichtet ist, und bewegen Sie sie, um auf dem Filterpapier zu ruhen.
Heben Sie das Filterpapier an den Rändern nach oben an, so dass das halbierte Stück Netzhaut das Filterpapier berührt. Heben Sie das Filterpapier weiterhin aus der Ringer-Lösung heraus. Legen Sie dann die Unterseite des Filterpapiers auf ein Papiertuch und tupfen Sie es zwei- bis dreimal vorsichtig ab, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
Als nächstes nehmen Sie das Filterpapier mit einer Pinzette auf und fügen Sie einen Tropfen kalter Ringer auf die Seite des Filterpapiers mit der Netzhaut hinzu. Legen Sie das Filterpapier erneut auf das Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Lagern Sie jede geklebte Netzhaut- und Filterpapierprobe in einer Petrischale, die mit kalten Ringern gefüllt ist, bis alle Proben eingefroren werden können.
Heben Sie dann mit einer Pinzette jede Probe aus dem Puffer des kalten Ringers heraus und stellen Sie sicher, dass die Pinzette nur die Filterpapierränder berührt und die halbierte Netzhaut vermeidet. Legen Sie die Unterseite jedes Filterpapiers auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Fügen Sie dann einen Tropfen kaltes PBS auf die Seite des Filterpapiers auf, wo die Netzhaut haftet, und tupfen Sie das Filterpapier erneut auf das Papiertuch.
Legen Sie alle Filterpapierstücke in die Petrischale und leiten Sie mit fusselfreiem Seidenpapier überschüssige Flüssigkeit ab, die das Filterpapier umgibt. Wickeln Sie dann die gesamte Schale mit Alufolie fest ein und stellen Sie sicher, dass die Kanten der Aluminiumfolie gesichert und sanft in den Boden der Petrischale gedrückt werden. Eine Handvoll 0,1 bis 0,2 Millimeter große Löcher in den Deckel der Aluminiumfolie einstechen.
Als nächstes senken Sie mit einer Metallzange die mit Aluminiumfolie überzogene Petrischale allmählich in flüssigen Stickstoff ab. Bewahren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff auf, bis sie zur Lyophilisation bereit sind. Zur Lyophilisation legen Sie die mit Aluminiumfolie überzogene Petrischale in einen Gefriertrocknungskolben und befestigen Sie sie gemäß dem Protokoll des Herstellers an der Lyophilisatormaschine.
Lyophilisieren Sie die Netzhaut für 30 Minuten. Sammeln Sie nach der Lyophilisation das äußere und innere Segment des Stabes, indem Sie vorsichtig ein kleines Stück Klebeband auf die lyophilisierte Netzhaut legen und leichten Druck mit der Pinzette ausüben, um sicherzustellen, dass sie sich mit der Photorezeptorschicht verbindet. Ziehen Sie das Band langsam ab und stellen Sie sicher, dass sowohl der ROS als auch der RIS am Band haften.
Ein dünner, weißer Film wird an der gebrochenen Oberfläche vorhanden sein. Das ist das RIS. Um dieses RIS zu trennen, legen Sie ein weiteres Stück Klebeband und drücken Sie das Band auf die gebrochene Oberfläche.
Legen Sie dann das Stück Klebeband mit nur der orange-rosa Schicht in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das als ROS gekennzeichnet ist, und Stücke von Klebeband mit der dünnen, weißen Schicht in ein anderes Röhrchen mit der Bezeichnung RIS. Als nächstes sammeln Sie mit Klebeband das verbleibende Netzhautgewebe, das sich auf dem Filterpapier befindet, indem Sie die dicke, weiße Schicht abziehen. Legen Sie dieses Isolat dann in eine Röhre mit der Bezeichnung OIS.
Wenn Sie am selben Tag verwenden, lagern Sie die isolierten Schichten der lyophilisierten Netzhaut bei Raumtemperatur. Bei dunkel angepassten Tieren stimmte die Verteilung von GNAT1 und ARR1 eng mit ihren bekannten Dunkelzustandsverteilungen überein, wobei das GNAT1-Signal in der ROS-Isolierung sichtbar am stärksten war und das ARR1-Signal in der ROS-Isolierung robuster war. Die Quantifizierung der GNAT1- und ARR1-Signale zeigte signifikante Unterschiede zwischen den Dunkellichtbedingungen für GNAT1 und ARR1 in ROS- und ROS-Proben.
Sowohl in dunklen als auch in lichtangepassten Proben werden G-Beat-5S-, Cytochrom-C- und Aktinsignale aus den ROS-Proben ausgeschlossen, was eine Abwesenheit von Kontamination durch andere Zellschichten zeigt. Zusätzlich war das G beta 5L-Signal in den ROS-Proben deutlich sichtbar. Die Rasterelektronenmikroskopie der Oberflächen intakter und geschälter lyophilisierter Netzhaut zeigte, dass vor dem Ablösen mit Klebeband die Oberfläche der intakten lyophilisierten Netzhaut eng mit dem charakteristischen zylindrischen ROS übereinstimmte.
Nach dem anfänglichen Bandpeeling schienen ROS und RIS vollständig entfernt zu sein, wie die gleichmäßige Kernschicht auf der Oberfläche der übrig gebliebenen, geschälten, lyophilisierten Netzhaut zeigt. Nachfolgende Bandabschalen entfernten RIS von der freien Oberfläche der geschälten Schicht. Diese Technik zeigte auch, dass die GRK1-Immunreaktivität in ROS-Proben in lichtexponierten Netzhäuten am intensivsten war und in OIS-Proben fehlte.
Umgekehrt zeigten ROS- und RIS-Proben ein schwaches Signal für PKC alpha, das in ROS oder RIS üblicherweise nicht durch Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen wird. Schließlich könnte ein suboptimales Bandpeeling leicht kontaminierte Proben ergeben. Die RIS-Probe war mit einer OIS-Probe kontaminiert, wodurch sowohl G beta 5L- als auch G beta 5S-Bänder und ein höheres PKC-Alpha-Signal erzeugt wurden.
Bei der Lyophilisation der Netzhaut ist Vorsicht geboten. Wenn eine unsachgemäße Lyophilisationstechnik verwendet wird, kann die Netzhaut schmelzen, was die Isolierung verschiedener subzellulärer Stäbchenschichten durch Klebeband unmöglich macht. Die Verwendung dieser Bandpeeling-Methode in Verbindung mit der qRT-PCR hat die Trennung von Photorezeptortranskripten vom Rest der Netzhaut ermöglicht.
