Hier stellen wir einen Workflow bereit, der die beste bioinformatische Methode zur Durchführung der Experimente zur Beurteilung der Wirkung von Glyphosat auf Mikrobiome umfasst. Der Hauptvorteil besteht darin, dass es eine robuste testbare Hypothese für zukünftige Feld- und Laborexperimente bietet. Die beschriebene Methodik kann auf eine Vielzahl von Systemen angewendet werden, einschließlich Pflanzen, Tiere und Mikroben.
Jeder Teil der Methodik ist ziemlich einfach. Der vielleicht schwierigste Teil besteht darin, ein multidisziplinäres Team zu integrieren, das in der Lage ist, verschiedene Teile der Arbeit auszuführen. Das Verfahren wird Suni Matthew, eine Forscherin aus meinem Labor, demonstrieren.
Beginnen Sie mit dem ersten Experiment, indem Sie das Versuchsfeld in 10 Replikate der Kontrolle und GBP-Behandlung mit Pufferstreifen der Vegetation zwischen den Parzellen aufteilen. Behandeln Sie die Kontrollflächen mit Leitungswasser und die GBP-Parzellen mit kommerziellem GBP, um die maximal zulässige Glyphosatdosierung in landwirtschaftlichen Praktiken nachzuahmen. Probieren Sie die Mikrobiota aus Versuchspflanzen.
Sammeln Sie 10 Nachbildungen der Pflanzenproben vom Feld, legen Sie sie sofort auf Eis und bringen Sie sie zur weiteren Verarbeitung ins Labor. Für das zweite Experiment sammeln Sie in einem 12-monatigen Volierenexperiment Bettwäsche, einschließlich Holzspäne, Kot und etwas verschüttetes Futter von Wachteln, die mit GBP-kontaminierten oder Kontrollfuttermitteln gefüttert wurden. Senden Sie die Einstreuproben direkt nach dem Verteilen an ein akkreditiertes Labor für die Glyphosat-Konzentrationsmessungen.
Pflanzen Sie mehrjährige Gras- und Erdbeerpflanzen in jeder Parzelle, um ihre Wurzel- und Blattmikrobiota zu untersuchen. Identifizieren und entfernen Sie die endophytischen Mikroben, indem Sie die Pflanzenproben waschen und sterilisieren. Sobald die Proben sterilisiert sind, extrahieren Sie genomische DNA mit einem kommerziell erhältlichen pflanzlichen DNA-Extraktionskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
Mit einem verschachtelten Ansatz amplifizieren Sie die variablen Regionen V6 bis V8 des 16S rRNA-Gens und machen Sie einen PCR-Master-Mix für die erforderliche Anzahl von Proben, wie im Textmanuskript beschrieben. Verwenden Sie für die erste Runde der PCR die Primer 799 vorwärts und 1492 rückwärts. Richten Sie das Verstärkungsprofil im Thermocycler für 35 Zyklen ein.
Um die Amplifikation zu überprüfen, führen Sie eine Elektrophorese mit fünf Mikrolitern amplifiziertem Produkt durch und verdünnen Sie dann die restlichen 25 Mikroliter des PCR-Produkts in autoklaviertem Reinstwasser im Verhältnis eins zu 10. Mit den Universalprimern 1062 vorwärts und 1390 rückwärts führen Sie die zweite Verstärkungsrunde mit 25 Zyklen durch. Verdünnen Sie die resultierenden PCR-Produkte in autoklaviertem Reinstwasser in einem gleichen Verhältnis.
Führen Sie die dritte Verstärkungsrunde mit acht Zyklen durch, um die Produkte mit den Barcodes und der P1-Adaptersequenz zu kennzeichnen. Überprüfen Sie die Qualitätskonzentration von PCR-Produkten auf einem Bioanalysator und legen Sie die Volumina, die 30 Nanogramm DNA jeder Probe ausmachen, in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen zusammen, um eine äquimolare Bibliothek vorzubereiten. Wählen Sie die Amplicons der Größe 350 bis 550 Basenpaare durch Größenfraktionierung unter Verwendung eines automatisierten DNA-Größenselektionssystems auf einer Agarosegelkassette aus.
Sammeln Sie die Elute, die die Amplikons der angegebenen Größe enthält, in einer Durchstechflasche in der Kassette, was zu einer gereinigten 16S rRNA-Genbibliothek führt. Überführen Sie das gesammelte Elutionsmittel in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und überprüfen Sie die Reinheit und Konzentration auf dem Bioanalysator. Verdünnen Sie die DNA-Bibliothek mit autoklaviertem Reinstwasser auf eine Endkonzentration von 26 Picomolar.
Um die ITS-Region zu verstärken, stellen Sie nach dem Einrichten der Reaktion mit ITS-Grundern das Verstärkungsprofil auf dem Thermocycler ein. Analysieren Sie dann fünf Mikroliter des amplifizierten Produkts auf 1,5% Agarosegel und verdünnen Sie die restlichen 25 Mikroliter des Produkts im Verhältnis von eins zu 10 mit autoklaviertem Reinstwasser. Erstellen Sie einen PCR-Master-Mix für die erforderliche Anzahl von Proben mit Barcode-getaggten Vorwärtsprimern und P1-Adapter-getaggten Reverse-Primern.
Verwenden Sie das verdünnte PCR-Produkt als Vorlage, führen Sie die zweite Runde der Verstärkung durch. Ähnlich wie bei der Bibliotheksvorbereitung für das 16S rRNA-Gen bereiten Sie die Bibliothek für die gereinigte ITS-Region vor. Initiieren Sie die bioinformatischen Analysen der EPSPS-Proteinsequenz.
Bewerten Sie die potenzielle Empfindlichkeit der Abfragesequenz gegenüber Glyphosat aus den vom Server bereitgestellten Ausgaben, wobei die erste Ausgabe den Anteil der in den Abfragesequenzen vorhandenen Aminosäuremarker und die Anzahl der Motive anzeigt. Ausgabe zwei zeigt die Ausrichtung der Abfrage- und Referenzsequenzen basierend auf Markerresten. Ausgabe drei zeigt vollständige paarweise Ausrichtungen der Abfrage- und Referenzsequenzen.
Ausgabe vier zeigt EPSPS-Referenzsequenzen von Vibrio cholerae, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis und Streptomyces davawensis. Am Ende der Ausgabeseite finden Sie Links zu externen Tools wie BLASTp und konservierten Domänen, um die Abfrage-EPSPS-Sequenz weiter zu analysieren. Nachdem Sie die EPSPS-Sequenzen aus den öffentlichen Repositories identifiziert haben, greifen Sie auf diese Datensätze von der Hauptseite des EPSPS-Klassenservers zu, die taxonomische Informationen und die EPSPS-Klasse mit über 50.000 Sequenzen enthält.
Wiegen Sie die oberirdische Biomasse der Pflanzen am Ende der Feldsaison, um das Wachstum der Pflanzen in GBP und Kontrollflächen zu vergleichen. Ordnen Sie in einer Tabelle die bakteriellen OTUs für Mikrobiomexperimente in vorberechneten Datensätzen ab. Und basierend auf einem probabilistischen Score, berechnen Sie die intrinsische Empfindlichkeit gegenüber Glyphosat.
Diese Methode wurde verwendet, um Veränderungen der Empfindlichkeit im EPSPS-Protein auf mikroevolutionärer Ebene zu quantifizieren. Wir identifizierten Veränderungen des Sensitivitätsstatus in 12 von 32 eng verwandten Gruppen von untersuchten Prokaryoten. So kann die kontinuierliche Anwendung der auf Glyphosat basierenden Produkte eine mikrobielle Dysbiose in den pflanzlichen, tierischen und Bodenmikrobiomen hervorrufen.
Stellen Sie die Qualität von Pre- und Post-PCR-Verfahren sicher, um optimale Amplikonbibliotheken zu erhalten. Stellen Sie außerdem sicher, dass die EPSPS-Proteinsequenz nicht partiell ist, bevor Sie die Software verwenden. Achten Sie bei Feldexperimenten darauf, eine Kontamination der Kontrollen mit Glyphosat zu vermeiden.
