Mit diesem Protokoll können wir wichtige Fragen beantworten, wie Mikroben sich in der Phyllosphäre zusammensetzen und interagieren. Es hat den zusätzlichen Vorteil, dass wir durch die Verwendung des sterilen Pflanzenextrakts die Struktur der Phyllo-Sphärengemeinschaften mit ihrer Funktion während der gemüselichen Gärung verknüpfen können. Diese Techniken ermöglichen es Wissenschaftlern, zu testen, wie Mikroben in der Phyllo-Sphäre interagieren, und dann zu verfolgen, wie diese Phyllo-Sphärengemeinschaften die Fermentation beeinflussen können.
Um die Kohlsamen an die Oberfläche zu sterilisieren, beginnen Sie mit 100 Samen in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie einen Milliliter 70% Ethanol in die Röhre und wirbeln Sie es für fünf Minuten. Verwenden Sie dann eine Pipette, um das Ethanol zu entsorgen.
Fügen Sie einen Milliliter 50% Bleichmittel und Wirbel das Rohr für fünf Minuten, dann entsorgen Sie die Bleiche. Spülen Sie die Samen viermal, indem Sie einen Milliliter autoklaven entionisiertes Wasser hinzufügen, das die Röhre durchwirbelt, und dann das Wasser entsorgen. Nach der letzten Spülung die Samen in sterilisiertem entionisiertem Wasser zwei bis acht Stunden einweichen, um die Samenschicht vor dem Pflanzen zu erweichen.
Wiegen Sie 10 Gramm sauberen Kalziumton in ein 15 mal 2,5 Zentimeter großes Glasrohr. Fügen Sie etwa neun Milliliter vorbereitete MS Broth zu jeder Röhre, um den Kalziumton zu decken. Kappen Sie die Glasröhren locker mit 22 Millimetern Zwei-Wege-Reagenzglaskappen.
Autoclave die Rohre bei 121 Grad Celsius für 60 Minuten. Wenn Sie die Rohre aus dem Autoklaven entfernen, schieben Sie die Kappen auf die Glasrohre, um sie zu versiegeln, und kühlen Sie die Rohre vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur. Wenn die Rohre abgekühlt sind, verwenden Sie extra lange Zangen, um vorsichtig einen sterilen Kohlsamen in die Mitte jeder Röhre zu legen.
Schnüren Sie die Rohre in einem Sieben-Wege-Tray und legen Sie das Tablett unter Lichtregale mit einem 16-stündigen Lichtzyklus bei 24 Grad Celsius. Die Samen entwickeln ihr erstes wahres Blatt nach fünf Tagen, das ist das erste Gefäßblatt, nachdem sich die Kotyledonen gebildet haben. Es hat eine faltige Kante und ist mit Tricombs bedeckt.
Um den keimfreien Kohl auf Sterilität zu testen, greifen Sie die Basis der Pflanze vorsichtig mit sterilisierten Zangen und ziehen Sie ihn heraus. Bevor Sie den Kohl vollständig aus dem Rohr entfernen, schneiden Sie die Wurzeln vorsichtig mit einer sterilisierten Sezierschere ab. Dann die Kohlblätter in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr verdichten.
Fügen Sie 400 Mikroliter PBS in jedes Mikrozentrifugenrohr und verwenden Sie einen sterilen Mikrostöße, um den Kohl zu homogenisieren. Klinge 100 Mikroliter des Kohls homogenisieren auf Agarplatten, um sicherzustellen, dass eine breite Öffnung Pipettenspitze zu verwenden. Um Glyzerinbestände von impfenden Stämmen zu machen, streifen Sie einzelne Kolonien vorsichtig auf zwei oder drei neue Platten desselben Mediums aus.
Die Kolonien zwei bis fünf Tage lang rudern und dann von den Platten in ein 15 Milliliter konisches Rohr mit 15 Millilitern 15% Glycerin kratzen. Wirbel nisch das Rohr gründlich zu mischen. Aliquot einen Milliliter des gemischten Glycerin-Bestands in ein Mikrozentrifugenrohr und speichern Sie es 80 Grad Celsius, bis es zusammen mit den restlichen 14 Millilitern Glycerin-Lager verwendet werden kann.
Eine Woche vor der Anwendung den ein Milliliter Aliquot auf Eis auftauen und an mehreren verschiedenen Verdünnungen platzieren, um die Konzentration des Impfbestandes zu bestimmen. Wenn Sie bereit sind, den Kohl zu impfen, den Glycerinbestand auf Eis auftauen und auf die gewünschte Konzentration verdünnen. 10 Milliliter des verdünnten Vorrats in die sterile Pumpenflasche geben und fünf Sprays in ein großes Abfallsammelbecher pumpen.
Entfernen Sie den Deckel aus dem Kohlrohr und neigen Sie den Kohl in Richtung der Sprühflasche. Sprühen Sie jeden Kohl mit drei Pumpen der Impflösung, dann ernten Sie eine Teilmenge der Kohle, um die tatsächliche Eingangsinokulationskonzentration zu bewerten. Um den Kohl zu ernten, entfernen Sie ihn aus dem Rohr mit sterilisierten Zangen.
Schneiden Sie die Wurzeln mit einer sterilen Sezierschere ab und legen Sie sie vorsichtig in ein vorgewogenes steriles Mikrozentrifugenrohr. Zeichnen Sie das Gewicht des Kohls für zukünftige Berechnungen auf. 400 Mikroliter PBS in jedes Rohr mit dem Kohl geben und 30 Mal mit einem Mikro-Pestle mahlen, dann den Kohl mit breiten Öffnungspipettenspitzen verfärben.
Entfernen und entsorgen Sie die äußersten Blätter des Kohls und hacken Sie den restlichen Kohl, um in einen Mixer zu passen. Mischen Sie es zu einem feinen Fruchtfleisch und wiegen Sie das Kohlhomogenat. Fügen Sie zwei Milliliter destilliertes Wasser pro Gramm Kohl hinzu.
Dann filtern Sie die Kohlschlämme durch zwei Schichten Korbkaffeefilter. Die Gülle 20 Minuten lang in Zentrifugenrohre geben und zentrifugieren oder bis sich große Partikel aus der Lösung absetzen. Entfernen Sie den Überstand und achten Sie darauf, den pelletierten Kohlschutt nicht zu stören.
Um die Fermentationsbedingungen mit Standardsalzkonzentrationen nachzubilden, geben Sie dem Extrakt 2% Gewicht zu Natriumchlorid hinzu. Den Gemüseextrakt mit einem 0,2 Mikrometer-Filter, der an einem Vakuum befestigt ist, in sterile Schläuche geben und bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Die Samensterilisationsmethode wurde mit mehreren Napa-Kohlsorten getestet und alle zeigten ähnliche Wachstumsraten.
Andere Arten von Brassica gaben jedoch nur begrenzten Erfolg, da die Pflanzen entweder niedrige Keimraten nach der Sterilisation hatten oder der Stamm schnell sich zu einer spindly ungesunden Pflanze ausdehnte. Mikrobielle Isolate wurden entweder als Einzelne Stammisolate oder in Kombination mit einem anderen Isolat geimpft. Insgesamt 15 keimfreie Kohlsorten wurden für jede Behandlung getestet und entweder sofort, an vier Tagen oder 10 Tage nach der Impfung geerntet.
Die Isolate zeigten ein schnelles Wachstum in der Napa Kohlphyllosphäre. Zwei Hefen und drei Bakterien wurden in drei verschiedene Arten von sterilem Pflanzenextrakt oder SVE aus Rot, Grün und Napa Kohl geimpft. Das Wachstum der Inokulaten wurde über 14 Tage aufgezeichnet, indem fünf Mikroliter jeder Behandlung auf MRS- oder YPD-Agarplatten geplatttitiert wurden.
Messungen des pH-Wertes während der gesamten Fermentation zeigten, dass die Milchsäurebakterien in der Lage waren, den SVE auf Werte unter pH 4 zu säuern, was auf eine vergären Gärung hindeutet, die für den Verzehr sicher ist. Diese Methoden haben speziell auf das Kohlmikrobiom angewendet, könnten aber in anderen Pflanzensystemen nützlich sein. Es kann schwierig sein, das System steril zu halten, unsere Gliederungsprotokolle sind detailliert, aber wir fanden jeden Schritt wichtig.
