Ex-vivo- und In-vivo-Tiermodelle wurden für die Untersuchung mechanischer und chemischer Hornhautverletzungen eingerichtet. Die Technik bietet Forschern eine leicht aufzubauende Plattform, um mechanische und chemische Verletzungen der Hornhaut zu untersuchen. Um eine murine Hornhautepithelwunde zu erzeugen, markieren Sie die zentrale Hornhaut der anästhesierten Maus mit einer Hautbiopsie-Stanze, um einen gut umschriebenen und gut messbaren Bereich der Wunde zu bestätigen.
Drücke den Stempel vorsichtig über die zentrale Hornhaut, um eine kreisförmige Markierung zu hinterlassen Debride das Hornhautepithel bis zur Bowman-Schicht mit einem tragbaren Hornhautrostentferner mit einem 0,5-Millimeter-Grat, um sicherzustellen, dass die Bowman-Schicht nicht beschädigt wird. Entfernen Sie das restliche lose Gewebe am Wundrand mit einer Hornhautzange. Bestätigen Sie den Bereich des Debridements mit fluoreszierender Färbung, indem Sie einen Tropfen normaler Kochsalzlösung auf ein Fluoresceinpapier geben, um Fluorescein aufzulösen, und dann den fluoresceinhaltigen Tropfen auf den murinen Epitheldefekt geben, um ihn unter kobaltblauem Licht sichtbar zu machen.
Fahren Sie mit der Ex-vivo-Kultur des murinen Hornhautabriebwundmodells fort, indem Sie sanft auf die oberen und unteren Orbitalränder euthanasierter Mäuse drücken, um den Augapfel herauszudrücken. Führen Sie die Spitze der geschlossenen Hornhautschere in den retrobulbären Raum entlang der unteren Augenhöhlenwand ein und achten Sie darauf, dass sie nicht in den Augapfel eindringt. Halten Sie den Augapfel mit einer 0,3-Millimeter-Hornhautzange fest und schneiden Sie dann den Sehnerv und das periorbitale Weichgewebe mit einer Hornhautschere durch, um den Augapfel zu isolieren.
Für die Ex-vivo-Kultivierung von murinen Augäpfeln bereiten Sie eine 48-Well-Platte mit geschmolzenem Wachs im Inneren des Wells vor und warten auf die Erstarrung, dann machen Sie mit der Spitze einer Bindehautzange ein rundes Loch auf der Oberfläche des erstarrten Wachses, um die Augäpfel aufzunehmen. Legen Sie die geernteten Augäpfel direkt auf die 48-Well-Platte mit wachsbedeckten Böden und Seitenwänden, um eine Stabilisierung herzustellen. Kultivieren Sie die Augäpfel mit DMEM, das 1 % fötales Kälberserum enthält, mit oder ohne Antibiotika, je nach Zweck der Studie.
Tauchen Sie die Augenoberfläche in das Nährmedium ein, ohne dass der Augapfel schwimmt, und dokumentieren Sie den Verlauf der Wundheilung durch Fluoreszenzfärbung und Fotoaufnahme mit einer Digitalkamera unter kobaltblauem Licht. Um eine alkalische Verbrennung herbeizuführen, legen Sie ein kreisförmiges Filterpapier mit einem Durchmesser von 8 Millimetern in eine Petrischale. Geben Sie mit einer Pipette 0,5 normales Natriumhydroxid in die Petrischale, um die Filterpapiere einzuweichen, und lassen Sie die überschüssige Lösung aus dem Filterpapier ab, bevor Sie sie auf die betäubte Kaninchenhornhaut legen.
Achten Sie nach dem Öffnen der Augenlider mit einem Lidspekulum darauf, dass die Kaninchen-Nickhaut das Einführen des Filterpapiers nicht stört, und legen Sie das alkaligetränkte Filterpapier für 30 Sekunden auf die zentrale Hornhaut. Entfernen Sie das Filterpapier und spülen Sie die Augenoberfläche mit 10 Millilitern normaler Kochsalzlösung ab, um alkalisches Material auszuwaschen. Um den Hornhautdefekt zu vervollständigen, debride das Hornhautepithel innerhalb des trübbaren Bereichs mit einem Hornhautrostentferner bis zur Bowman-Membran.
Bestätigen Sie den Debridement-Bereich mit einer Fluorescein-Färbung unter dem kobaltblauen Licht und entfernen Sie das restliche Hornhautepithel mit einer Hornhautzange. Um den Wundzustand mit Tarsorrhapie zu sichern, vergewissern Sie sich, dass die Nickhaut die Augenoberfläche und den Hornhautepitheldefekt auf der Nasenseite glatt bedeckt. Führen Sie eine vorübergehende Tarsorrhaphie mit oder ohne topische Mittel mit einer 6-0-Naht durch, um die Augenoberfläche zu schützen und zu verhindern, dass das Kaninchen daran kratzt, stellen Sie sicher, dass die Naht für Tarsorrhaphie 3 bis 4 Millimeter vom oberen und unteren Lidrand entfernt ist, mit vier bis fünf Bändern und längeren Knoten, um zu verhindern, dass das Kaninchen die Nähte reißt.
Im Ex-vivo-Wundheilungsmodell des Hornhautepithels der Maus wurde nach dem in vivo Debridement des Hornhautepithels der Maus in den zentralen zwei Millimetern nach dem in vivo Debridement des Hornhautepithels der Maus leicht eingedrückter zentraler Hornhautbereich mit positiver Fluoresceinfärbung beobachtet. Die ex vivo Kultur der murinen Augäpfel, die auf einer wachsbeschichteten 48-Well-Kulturplatte fixiert waren, wurde täglich innerhalb einer 48-Well-Kulturplatte unter einem Stereomikroskop untersucht und dokumentiert. Einen Tag nach dem Entkernen des murinen Hornhautepithels zeigte sich auf digitalen Fotos, die unter kobaltblauem Licht aufgenommen wurden, ein kreisförmiger, fluoresceingefärbter Epitheldefekt von 2 Millimetern Durchmesser.
Nach einer Alkaliverletzung des Hornhautepithels des Kaninchens wurde eine positive Fluoresceinfärbung mit oder ohne kobaltblaues Licht über der zentralen Hornhaut mit einem klaren und vollständigen kreisförmigen Rand beobachtet. Die Reepithelialisierung der Hornhautepithelwunde mit Pannuseinwuchs wurde vom Limbus aus beobachtet. Die wichtigsten Schritte sind Verfahren, um glatte und gleichmäßige Epitheldefekte auf Hornhautoberflächen von Mäusen und Kaninchen zu erzeugen.
Auf diesen Plattformen können neue medizinische und chirurgische Therapeutika getestet werden. Der Effekt der Reepithelialisierung kann nach den Eingriffen überwacht werden. Die Neovaskularisation der Hornhaut und die Trübung nach einer Verletzung in diesem Protokoll wären ein ungedeckter Bedarf an weiterer Forschung.
