Supported by grants from the Department of Defense (W81XWH-09-1-0127), the NIH (2-R01-CA089569), the Elsa U. Pardee Foundation, a Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research Pilot Study Award, and generous philanthropic support from Section of Urology and Section of Research in the Department of Surgery, University of Chicago.

Alle Mäuse wurden untergebracht, gepflegt und eingeschläfert nach Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Richtlinien und unter der Leitung von der University of Chicago Tier Resource Center. 1. Vorbereitung für Versuche Studies <ol><li> Damit die Tiere auf neue Gehäuse und Umgebung zu akklimatisieren, um möglichen physiologischen Auswirkungen von Transport und Handhabung zu erholen. Anmerkung: Die folgenden Verfahren ist anwendbar auf alle kommerziell erhältlichen Stämme von Mäusen. Die Anzahl von Tieren, die in einem Experiment verwendet wird, hängt von der Studiendesign und sollte mit Beratung von einem statistician erfolgen. </li></ol> 2. Identifizierung und Isolierung von Peritoneal Fettdepots. <ol><li> Euthanize Tieren über CO 2 Überdosierung und einer sekundären physikalischen Verfahren zum Tode zu bestätigen. </li><li> Als Erntebauchfettdepots eine inländische Organentnahme (sekundäre Methode), make ein Mittellinienschnitt in der Nähe des Leisten Papillen durch die Bauchwand, um die inneren Organe (Abbildung 1A) aussetzen. </li><li> Für die Netzadhäsionen Fat (OM), setzen die omentalis / Pankreas-Komplex durch die Erweiterung der Milz aus der Bauchhöhle mit einer Pinzette (Abbildung 1c). Lassen Netz aus der Bauchspeicheldrüse und Milz durch alle Gewebeverbindungen eng Trimmen. Stellen Sie sicher, dass alle verbleibenden Pankreasgewebe wird ausgeschnitten 4. </li><li> Für die Keimdrüsen Fat (GF), verwenden Sie Pinzette, um die Gonaden Fett rund um die Eierstöcke und die Verbrauch durch Schneiden von Gewebe-Verbindungen (1A oberen righ t) 4 zu heben. </li><li> Für die Uterus Fat (UF), verwenden Sie Pinzette, um die Gebärmutter Fett rund um die Gebärmutterhörner und Verbrauch durch Schneiden von Gewebe-Verbindungen heben (Abbildung 1A unten rechts) 4. </li><li> Für die mesenterialen Fettgewebe (MF), schneiden Sie den Übergang zwischen dem Dünndarm und dem Pylorus. Verwenden einer Pinzette fest zu ergreifen das freie Endeder Dünndarm, und langsam &quot;peel&quot; es von der mesenterialen Fett. Lassen Sie die mesenterialen Fett aus dem Mesenterialwurzel Verwendung Präparierscheren (1A unten links) 4. </li><li> Für die Splenoportal Fat (SF), heben Sie das distale Ende der Milz mit einer Pinzette, um die dünne Fettgewebeband Anschluss des Milzhilus der Bauchspeicheldrüse freizulegen. Auszuschneiden die splenoportal Fett durch zuerst Lösen aus der Bauchspeicheldrüse, und dann sorgfältig seziert es aus der Milz (1B) 4. </li></ol> 3. Milch Spot-Identification Mit Giemsa <ol><li> Verbrauch Omenta (siehe Schritt 2.3) von C57BL / 6 Mäusen und fixieren in 5% neutral gepuffertem Formalin bei 4 ° C für 16 Stunden (O / N). </li><li> Für Paraffin Einbetten des festen Gewebes, wählen Sie eine Form, die für die Größe des Gewebes geeignet ist. Gießen geschmolzenes Paraffin aus dem Paraffinvorratsbehälter, um die Form zu füllen. Öffnen Sie die Kassette und mit warmSteinpilzen, übertragen das Gewebe in die Form. <ol><li> Sorgfältig orientieren das Gewebe während der Paraffineinbettung zu Längsschnitten zu erzeugen. Setzen Sie die markierten Gewebekassette über das Formteil und drücken Sie fest an seinem Platz. Erlaube der Gießform für mindestens 30 min abkühlen. </li></ol></li><li> Schneiden Sie Serienschnitte (4 &amp; mgr; m dick) aus der Formalin-fixierten Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebeblock. Legen Sie eine vorgereinigte Objektträger unter den Abschnitten, wie das Band von Gewebe löst sich der Paraffinblock. </li><li> Seriell Abschnitt das ganze Netz; zu sammeln und zu färben jeden dritten Abschnitt Giemsa-Färbung (siehe 3.6). Lassen Sie die Objektträger mit den Abschnitten an der Luft trocknen, vorzugsweise O / N bei RT. Getrocknete Folien sind bereit für die Fixierung. Beflecken den ersten Abschnitt für die Hämatoxylin und Eosin für Vergleiche mit Giemsa gefärbten Objektträger. </li><li> Entparaffinieren Rutschen durch zwei aufeinanderfolgende 5 min Inkubation in Xylol. Rehydrieren gleitet durch zwei aufeinanderfolgende Inkubationen in folgendem: 100% Ethanol, 95% Ethanol, und schließlich tippen water. <ol><li> Treffen Sie geeignete Vorsichtsmaßnahmen, um die Folien vor dem Austrocknen zu vermeiden. Führen Sie alle Schritte bei RT. </li></ol></li><li> Vollständig einzutauchen, die Folien in einer Coplin-Gefäß, das 5% Giemsa-Lösung (w / v in Leitungswasser) und Inkubation für 4 min bei RT. Spülen Sie gleitet in Leitungswasser für 60 Sekunden, an der Luft trocknen und eindecken mit Deckglas mit Montage Medien. </li><li> Bild der gefärbten Objektträger unter Verwendung eines Whole Slide Scanner und Prozess mit Herstellersoftware. Quantifizierung der milchigen Ort Volumen in den Giemsa-gefärbten omentalis Abschnitte mit ImageJ Software 4. </li></ol> 4. Vermehrung und Herstellung von Eierstockkrebszellen für in vivo und ex vivo-Studien <ol><li> Vorwärmen 15 ml Zellwachstumsmedium auf 37 ° C in einem Wärmebad. Einem passenden Gewebekulturflasche (zB 75 cm 2 Fläche) Bereiten Sie durch Markierung mit Namen der Zelllinie, Durchgang Nummer, Datum und Person, die die gefrorenen Lager vorbereitet, und das Datumund Person, die das Auftauen / Ausplattieren der Zellen. Hinweis: In Studien der Metastasierung solcher Informationen ist entscheidend, da das Datum der Gefriert nach unten und Passage-Nummer können die metastatischen Phänotyp beeinflussen. </li><li> Unter Verwendung der sterilen Umgebung der biologischen Schutzhaube, Pipette 10 ml Medium in die T-75-Kulturflasche. Entfernen Sie ein Fläschchen mit Zellen aus dem flüssigen Stickstoff Systems und überprüfen Sie das Etikett, um den Zelltyp zu bestätigen. Tauen nur eine Ampulle von Zellen zu einem Zeitpunkt durch Erwärmen in 37 ° C Wärmebad. </li><li> Unter Einhaltung steriler Techniken Pipetten 1x10 6 aufgetauten Zellen in die Kulturflasche. Der Kolben wird in den Inkubator, damit Zellen zu befestigen. Der Kolben schaukeln hin und her, um eine einheitliche Zellsuspension zu bilden. <ol><li> Danach wird der Kolben in Gewebekultur-Inkubator und zu halten, bei 37 ° C in 5% CO 2 Umgebung. Erlauben Zellen O / N entsprechen. </li></ol></li><li> Absaugen Medien, und ersetzen Sie mit frischem vorgewärmten Wachstumsmedien. Der Kolben wird in den Inkubator und alleow Zellen wachsen. Überwachung des Zellwachstums täglich durch visuelle Inspektion alle 2-3 Tage unter Verwendung eines Umkehrmikroskops. Verwenden Sie Standard-Zellkulturtechniken, um Durchgang-Zellen bei Erreichen 70-80% Zusammenfluss. Hinweis: Für die experimentellen Untersuchungen Ernte der Zellen bei 70% Konfluenz, um sicherzustellen, dass die Zellen aktiv vermehren. </li><li> Absaugen Kulturmedium und spüle mit 10 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Absaugen PBS und fügen Sie 0,25% Trypsin / EDTA (2 bis 3 ml für eine 75 cm 2 Oberfläche) und inkubieren Sie 5 Minuten bei 37 ºC. Visuell zu bestätigen, dass die Zellen abgelöst und dasselbe Volumen des Wachstumsmediums, und sanft Pipette Zellen nach oben und unten, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Anmerkung: Es ist wichtig, dass das Wachstumsmedium Serum enthält, wie es inaktiviert Trypsin. Werden mindestens 2 bis 4-fach mehr Zellen als die Zahl für ein gegebenes Experiment erforderlich, um den Verlust an Zellen während der nachfolgenden Schritte zu kompensieren </li><li> Den Prozentsatz der lebensfähigen Zellen in derSuspension über Trypanblau-Ausschluss-Assay unter Verwendung eines Hämacytometers oder eine automatische Zellzähler. Hinweis: Hier werden nur verwenden Zellpräparate, in denen ≥ 96% der Zellen lebensfähig sind. </li><li> Übertragen der Zellsuspension aus dem Kolben in ein 50 ml konischen Röhrchen. Pellet-Zellen durch Zentrifugieren 5 Minuten bei 1100 × g bei 4 ° C. </li><li> Saugt den Überstand und Zellpellet in PBS auf eine Konzentration von 2x10 6 Zellen pro ml. </li></ol> 5. Intraperitoneale Injektion von Zellen Hinweis: In unseren Experimenten werden die Mäuse in einem laminaren Luftstrom oder Biosicherheitswerkbank innerhalb unseres Sperreinrichtung, um das Risiko der Krankheitserreger Exposition zu begrenzen, um diese Technik zu zeigen deutlich, behandelt, die Verfahren in der dazugehörige Video wurden in einem Laboratorium zugelassen durchgeführt Tier Arbeit. Diese besondere Technik nicht die Tiere benötigen, um unter Narkose ist. Unter genehmigten Protokollen, führen Sie diese technique an lebenden Tieren. Verwenden Sie geeignete Stämme von Mäusen für diese Studie. Zum Beispiel: verwenden immungeschwächten, athymischen Nacktmäusen für das Studium der menschlichen Eierstockkrebszell (SKOV3ip.1 und HeyA8) Kolonisierung; Verwenden immun C57BL / 6 Mäusen Untersuchung der Mauseierstockkrebszellen (ID8) Kolonisation. <ol><li> Last 500 ul der Einzelzellsuspension in die Spritze und in den steriles verschlossenes 25 G Nadel gesetzt. Dies reduziert Zell Abscheren vor der Injektion. </li><li> Wählen Sie die Maus nach oben durch das Genick des Halses und halten Sie das Endstück mit der Handfläche und Zeigefinger und befestigen Sie den linken Hinterbein zwischen dem Ring und kleinen Finger (wenn die Maus mit der linken Hand zurückgehalten). Hinweis: Um traumatisierende Bauchorgane zu vermeiden, die Maus auch zurückhalten, so dass es nicht während der Injektion zu bewegen. </li><li> Stellen Sie sich eine Linie quer Bauch knapp über den Knien, und suchen Sie einen Punkt auf der rechten Seite des Tieres und in der Nähe der Mittellinie. Der Eintrittspunkt ist kranial und leicht medialder letzten Brustwarze. Hinweis: Einsetzen der Nadel auf der Maus über die rechte Seite vermeidet den Blinddarm und reduziert das Risiko der Punktion der Darm 11. </li><li> Führen Sie die Nadel am unteren Seitenbereich der Mäuse Leib bis zu einer Tiefe von etwa 0,5 cm. Ziehen Sie am Kolben, um zu bestätigen, dass die Nadel nicht in ein Blutgefäß oder andere Bauchorgane eingedrungen. <ol><li> Ist eine Flüssigkeit abgesaugt entsorgen Sie die Spritze (und Probe) 11. Ein grünlich-braun oder gelb absaugen zeigt Nadelpenetration in den Darm oder die Blase auf. </li></ol></li><li> Injizieren Sie die Probe unter Verwendung von langsamen, stetigen Druck. Ziehen Sie die Nadel und kehren Sie die Maus auf seinem Käfig. Spritzen rekapitulieren Sie nicht vor der Entsorgung im Behälter für spitze Gegenstände. </li><li> Sacrifice Mäusen über CO 2 Ersticken und lebenswichtigen Organentnahme zu bestimmten Zeitpunkten nach der Injektion. </li></ol> 6. Milch Stelle Kolonisations In-vivo- <ol><li> Quantitation von Krebszellortung, um milchige Flecken mit Hilfe der Durchflusszytometrie <ol><li> Isolieren Bauchfettdepots von Mäusen, die (wie in Schritt 2.3 - 2.7) injiziert mit fluoreszenzmarkierten Krebszellen und sofortige Ort Gewebe in eiskaltem PBS. <ol><li> Für diese spezielle Technik, Gewicht-match all Fettgewebe Fettgewebe zu Netz. Übertragungsgewebe zu 5 ml-Röhrchen mit 1,5 ml serumfreiem DMEM und 0,1% (w / v) Rinderserumalbumin zu trennen. Aus drei unabhängigen Mäusen geerntet Pool Geweben, um eine ausreichende Ausbeute an Zellen für die Flusszytometrie gewährleisten. </li></ol></li><li> Mince Gewebe mittels chirurgischer Scheren und 1,5 ml serumfreiem DMEM, das 0,4% (w / v) Kollagenase I. Die Gewebesuspension Inkubieren bei 37 ° C für 30 min mit einer Drehmisch. <ol><li> Als optionalen Schritt, weitere distanzieren Gewebe durch Kauen. In diesem Fall übertragen die gewebe Kollagenase Suspension auf eine microstomacher Beutel, kauen für 10 Minuten bei schwacher, Drehen der Orientierungder Beutel nach 5 min. </li></ol></li><li> Filterproben durch eine Nylon-Mesh-Filter (60 &amp; mgr; m Poren), um größere Ablagerungen zu entfernen. Sammeln Zellen durch Zentrifugation bei 250 × g für 5 min bei 4 ° C und der Überstand verworfen Fraktion. </li><li> Zellpellet in 100 ul PBS in Kombination mit 900 ul ACK-Lysepuffer und Inkubation bei Raumtemperatur für 1 min. Zentrifuge Zellen bei 250 g für 5 min und Überstand verwerfen. <ol><li> Zellpellet in 250 ul eiskaltem PBS. Filtern Sie die Proben durch ein 60 &amp; mgr; m Poren Nylon-Mesh auf Einzelzellsuspension zu gewährleisten. Spülen Sie den Filter mit 250 ul eiskaltem PBS. </li></ol></li><li> Quantifizieren der Anzahl von fluoreszierend markierten Zellen in der Population mit einem Durchflusszytometer mit einem 561-nm gelb-grünen Laser ausgerüstet und 585 nm / 15 nm Bandpassfilter. Eingestellt das Tor für tdTomato positiven Zellen basierend auf der Analyse der elterlichen Zellen und / oder entsprechenden Negativkontrollen 4. </li></ol&gt; </li><li> Quantifizierung von mikroskopischen und makroskopischen Metastasen <ol><li> Bei dem gewünschten experimentellen Endpunkt (en), isolieren und sofort setzen Gewebe in der geeigneten Fixierungsmedien. Fix größeren Proben, wie intakt Gonaden, Uterus und mesenterischen Fettdepots in 10% neutral gepuffertem Formalin für 48 Stunden bei 4 ° C. Fix kleinere Proben (omentalis und splenoportal Fett sowie Gewebeäquivalenten von Gebärmutter und mesenterialen Fett) in 5% neutral gepuffertem Formalin bei 4 ° C für 2 bis 16 h. <ol><li> Alternativ Schnapp einfrieren Gewebe, indem sie in einem Gefriermedium wie Oktober und fallen in eine entsprechende Menge an flüssigem Stickstoff. </li></ol></li><li> Transfer fixierten Geweben um 70% Ethanol und bei 4 ° C bis zur Einbettung in Paraffin. Einbetten und Prozessgewebe wie in 3.2 und 3.3 beschrieben. <ol><li> Verwenden die H &amp; E gefärbten Abschnitt, um Gewebe auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von mikroskopischen Metastasen auszuwerten (dh Cluster von 50 Zellen). Bestätigen ter Anwesenheit mikroskopischen Metastasen durch eine sekundäre Verfahren, wie ein IHC Färbung für Cytokeratin 8/18 auf Eierstockkrebszellen zu erkennen. </li></ol></li></ol></li></ol> 7. Milch Stelle Kolonisations Ex Vivo <ol><li> Einrichtung von Grund ex vivo omentalis Organkulturbedingungen <ol><li> Legen Sie jedes Netz in einem einzigen Kulturplatte Einsatz und innerhalb einer Vertiefung einer Zwölf-Gewebekulturplatte, die 500 &amp; mgr; l DME / F12-Medium, das 20% FCS. Aufrechtzuerhalten Organkulturen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Umgebung für 24 bis 48 h und / oder zusätzliche Zeitpunkten. Verwenden Sie drei unabhängige Omenta (Dreifachproben) für jede Bedingung (zB Medientyp / Zeitpunkt). </li><li> Um die Integrität der Gewebe an den experimentellen Endpunkten zu bestätigen, zu fixieren und Prozessproben, wie in Schritt 3 beschrieben Zählen gesunde gegen nekrotischen Adipozyten auf H &amp; E Schnitte Gewebeintegrität zu bewerten. Ein Minimum von ~ 120 Zellen aus5 biologischen Proben erforderlich ist, um einen Prozentsatz von lebendem Gewebe vorhanden 10 zu formulieren. </li><li> Um Gewebefunktion, Ort Omenta (n = 3) in getrennten Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen, die 500 &amp; mgr; l DME / F12-Medium mit 20% FCS zu messen. Erlauben Omenta, die Medien bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Umgebung 24 Stunden lang zu konditionieren und dann zu entfernen 250 ul zur Verwendung in einer IL-6 ELISA-Test 10. </li></ol></li><li> Ex-vivo-Co-Kultur des Maus-Netz mit SKOV3ip.1-GFP-Zellen <ol><li> Wachsen und bereiten fluoreszierend markierten Zellen, wie in Kapitel 4 und resuspendieren in einer Konzentration von 2 × 10 6 Zellen pro ml beschrieben. </li><li> Gelten ~ 6 &amp; mgr; l des Gewebeklebers auf die Membran des Kultureinsatzes und lassen es an der Luft trocknen. Zweimaliges Waschen der Membran mit sterilem Wasser, um eine übermäßige Kleber zu entfernen. Luft trocknen die Membranen unter einem laminaren Haube. </li><li> Vorsichtig herauszuschneiden die Omenta und befestigen es an der klebstoffbeschichteten membrane mit einer sterilen Pinzette. Damit das Gewebe an die Membran für 1 Minute vor der Zugabe von Medium zu haften. Fügen Sie 500 ul der Zellsuspension auf der jeweils Netzes in jedem Kultureinsatzes. Füllen Sie den Bereich um den Transwell-Kammer mit 2,5 ml DME / F-12 10. </li><li> Inkubieren Omenta mit Zellsuspension für 6 h bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Umgebung. Entfernen Sie vorsichtig und waschen Sie die Omenta mit ~ 10 ml PBS. Visualisieren Fluoreszenzkrebszellherde mit einem geeigneten Fluoreszenzbildgebungssystem 10. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bast, R. C., Hennessy, B., Mills, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+ovarian+cancer:+new+opportunities+for+translation.">The biology of ovarian cancer: new opportunities for translation.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (6), 415-428 (2009).</li><li>Bowtell, D. D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genesis+and+evolution+of+high-grade+serous+ovarian+cancer.">The genesis and evolution of high-grade serous ovarian cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (11), 803-808 (2010).</li><li>Colgan, T. J., Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18+Familial+Cancer+and+Prophylactic+Surgery.">Chapter 18 Familial Cancer and Prophylactic Surgery.</a> Diagnostic Pathology of Ovarian Tumors. , 277-288 (2011).</li><li>Clark, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milky+Spots+Promote+Ovarian+Cancer+Metastatic+Colonization+of+Peritoneal+Adipose+in+Experimental+Models.">Milky Spots Promote Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Peritoneal Adipose in Experimental Models.</a> The American Journal of Pathology. 183 (2), 576-591 (2013).</li><li>Platell, C., Cooper, D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+omentum.">The omentum.</a> World Journal Of Gastroenterology: WJG. 6 (2), 169-176 (2000).</li><li>Hagiwara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milky+spots+as+the+implantation+site+for+malignant+cells+in+peritoneal+dissemination+in+mice.">Milky spots as the implantation site for malignant cells in peritoneal dissemination in mice.</a> Cancer Research. 53 (3), 687-692 (1993).</li><li>Gerber, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+Attachment+of+Peritoneal+Tumor+Metastases+to+Omental+Immune+Aggregates+and+Possible+Role+of+a+Unique+Vascular+Microenvironment+in+Metastatic+Survival+and+Growth.">Preferential Attachment of Peritoneal Tumor Metastases to Omental Immune Aggregates and Possible Role of a Unique Vascular Microenvironment in Metastatic Survival and Growth.</a> The American Journal of Pathology. 169 (5), 1739-1752 (2010).</li><li>Liebermann-Meffert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+greater+omentum.+Anatomy,+embryology,+and+surgical+applications.">The greater omentum. Anatomy, embryology, and surgical applications.</a> The Surgical Clinics of North America. 80 (1), 275-293 (2000).</li><li>Collins, D., Hogan, A. M., O&#8217;Shea, D., Winter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Omentum:+Anatomical,+Metabolic,+and+Surgical+Aspects.">The Omentum: Anatomical, Metabolic, and Surgical Aspects.</a> Journal of Gastrointestinal Surgery. 13 (6), 1138-1146 (2009).</li><li>Khan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+metastatic+colonization+of+human+ovarian+cancer+cells+to+the+omentum.">In vitro metastatic colonization of human ovarian cancer cells to the omentum.</a> Clinical, &amp; Experimental Metastasis. 27 (3), 185-196 (2010).</li><li>Shimizu, S., Hans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+of+Administration.">Routes of Administration.</a> The Laboratory Mouse. , 527-542 (2004).</li><li>Vang, R., Shih, I. -. M., Kurman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fallopian+tube+precursors+of+ovarian+low-+and+high-grade+serous+neoplasms.">Fallopian tube precursors of ovarian low- and high-grade serous neoplasms.</a> Histopathology. 62 (1), 44-58 (2012).</li><li>Folkins, A. K., Jarboe, E. A., Roh, M. H., Crum, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursors+to+pelvic+serous+carcinoma+and+their+clinical+implications.">Precursors to pelvic serous carcinoma and their clinical implications.</a> Gynecologic Oncology. 113 (3), 391-396 (2009).</li><li>Li, J., Fadare, O., Xiang, L., Kong, B., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+serous+carcinoma:+recent+concepts+on+its+origin+and+carcinogenesis.">Ovarian serous carcinoma: recent concepts on its origin and carcinogenesis.</a> Journal of Hematology, &amp; Oncology. 5 (1), 8 (2012).</li><li>Kurman, R. J., Shih, I. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+pathogenesis+of+epithelial+ovarian+cancer:+a+proposed+unifying+theory.">The origin and pathogenesis of epithelial ovarian cancer: a proposed unifying theory.</a> The American Journal Of Surgical Pathology. 34 (3), 433-443 (2010).</li><li>Crum, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distal+fallopian+tube:+a+new+model+for+pelvic+serous+carcinogenesis.">The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis.</a> Current Opinion In Obstetrics, &amp; Gynecology. 19 (1), 3-9 (2007).</li><li>Crum, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+BRCA:+The+Tubal+Fimbria+Emerges+as+an+Origin+for+Pelvic+Serous+Cancer.">Lessons from BRCA: The Tubal Fimbria Emerges as an Origin for Pelvic Serous Cancer.</a> Clinical Medicine, &amp; Research. 5 (1), 35-44 (2007).</li><li>Foulkes, W. D., Narod, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+risk+and+family+history.">Ovarian cancer risk and family history.</a> The Lancet. 349, 878 (1997).</li><li>Antoniou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Average+Risks+of+Breast+and+Ovarian+Cancer+Associated+with+BRCA1+or+BRCA2+Mutations+Detected+in+Case+Series+Unselected+for+Family+History:+A+Combined+Analysis+of+22+Studies.">Average Risks of Breast and Ovarian Cancer Associated with BRCA1 or BRCA2 Mutations Detected in Case Series Unselected for Family History: A Combined Analysis of 22 Studies.</a> The American Journal of Human Genetics. 72 (5), 1117-1130 (2003).</li><li>King, M. -. C., Marks, J. H., Mandell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+York+Breast+Cancer+Study+Group+Breast+and+ovarian+cancer+risks+due+to+inherited+mutations+in+BRCA1+and+BRCA2.">New York Breast Cancer Study Group Breast and ovarian cancer risks due to inherited mutations in BRCA1 and BRCA2.</a> Science. 302 (5645), 643-646 (2003).</li><li>Kj&#230;r Kr&#252;ger, S., Gayther, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+and+genetic+susceptibility+in+relation+to+the+BRCA1+and+BRCA2+genes.+Occurrence,+clinical+importance+and+intervention.">Ovarian cancer and genetic susceptibility in relation to the BRCA1 and BRCA2 genes. Occurrence, clinical importance and intervention.</a> Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 85 (1), 93-105 (2006).</li><li>Easton, D. F., Ford, D., Bishop, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+and+ovarian+cancer+incidence+in+BRCA1-mutation+carriers.+Breast+Cancer+Linkage+Consortium.">Breast and ovarian cancer incidence in BRCA1-mutation carriers. Breast Cancer Linkage Consortium.</a> American Journal of Human Genetics. 56 (1), 265-271 (1995).</li><li>Rebbeck, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophylactic+Oophorectomy+in+Carriers+of+BRCA1or+BRCA2Mutations.">Prophylactic Oophorectomy in Carriers of BRCA1or BRCA2Mutations.</a> New England Journal of Medicine. 346 (21), 1616-1622 (2002).</li><li>Olivier, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcome+of+prophylactic+oophorectomy+in+BRCA1/BRCA2+mutation+carriers+and+events+during+follow-up.">Clinical outcome of prophylactic oophorectomy in BRCA1/BRCA2 mutation carriers and events during follow-up.</a> British Journal Of Cancer. 90 (8), 1492-1497 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Entwicklung von Therapien zu verbreiteZielZellen erfordert ein mechanistisches Verständnis von metastasierendem Kolonisierung, die kritische erste Schritt in der Entwicklung der Peritonealdialyse Krankheit. Um diese Probleme haben wir Ansätze, die verwendet werden können, zu erkennen, wie einzigartig das Netz der Gewebezusammensetzung und Architektur zu fördern Eierstockkrebs metastasierendem Kolonisierung berichten anzugehen. Unterscheidungsmerkmale unseres Ansatzes sind: 1) der Schwerpunkt auf frühe Erei...

Anders als die meisten soliden Tumoren, Metastasen sind aus hochwertigem seröse Ovarialkarzinom (HGSC) in die Bauchhöhle 1 beschränkt. So könnte wirksame Peritonealdialyse Therapien potenziell Bekämpfung oder Tilgung HGSC. Derzeit ist ein Standard-Therapieansatz chirurgische Zytoreduktion in Kombination mit Chemotherapie 1-3. Leider ist die überwiegende Mehrheit der Patienten und erliegen Komplikationen der Krankheit Wiederholung. Diese düsteren Statistiken zeigen die Notwendigkeit für ein besseres Verständnis von metastasierendem Kolonisierung, durch den der Prozess Krebszellen zu lokalisieren, um, zu nutzen, und vermehren sich im Wirtsgewebe Metastasen 2 zu bilden. Das Netz ist ein bevorzugter Ort der frühen Metastasierung HGSC 4-7. Im Gegensatz zu anderen Bauch Fettgewebe enthält omentalis Fettgewebe ungewöhnlich wie milchige Flecken, die B, T und NK-Zellen und Makrophagen enthalten, die eine Schlüsselrolle in Bauch HomeOS spielen bekannten ImmunstrukturenTASIS 8,9. Zusätzlich zu ihren physiologischen Funktionen haben wir festgestellt, dass milchige Flecken, eine aktive Rolle bei Eierstockkrebs metastasierendem Kolonisierung 4 zu spielen. In experimentellen Metastasierung Assays SKOV3ip.1, Caov3 und HeyA8 (human) und ID8 (murine; C57BL / 6) Eierstockkrebszellen schnell Heimat milchige Flecken, was darauf hindeutet, daß die Zellen in Richtung auf ein sezerniertes chemotaktischen Faktor bewegt. Interessanterweise haben die Krebszellen nicht kolonisieren Bauch Fettgewebe fehlt milchige Flecken (dh Gonaden und Gebärmutter Fett) 4. Um Regulierungsmechanismen milchig Stelle Kolonisations zu identifizieren, haben wir Xenograft-Modellen, die die Vernehmung von zellulären und molekularen Ereignisse über den Zeitverlauf von metastasierendem Kolonisierung 4 ermöglichen optimiert. Ein besonderer Vorteil der hier beschriebenen Vorgehensweisen ist die Betonung der Gewebearchitektur und Funktion, der Benutzer zum Testen von Hypothesen in voll in vivo integriert und ex vivo Modellen von m ermöglichtetastatic Kolonisierung 4,10. Durch den Vergleich von Krebszellen Lokalisierung und Wachstum in Bauchfettdepots, die entweder enthalten oder fehlen milchige Flecken, können die Ermittler den relativen Beitrag (n) der Fettzellen und Zellen innerhalb milchige Flecken an den Unterkünften und progressive Wachstum von Eierstockkrebszellen in physiologisch relevanten Geweben zu testen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissection Tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geimsa</td>
			<td>Fluka/Sigma Aldrich</td>
			<td>48900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Without calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>329652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stomacher</td>
			<td>Seward Labsystems</td>
			<td>Stomacher 80 Biomaster</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microstomacher bag</td>
			<td>Stomacher Lab Systems</td>
			<td>BA6040/Micro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture plate insert</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>BD</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer metastatic colonization of milky spot structures in peritoneal adipose

Hochwertige seröse Ovarialkarzinom (HGSC), die Ursache der weit verbreiteten Peritonealmetastasen, weiterhin eine extrem schlechte Prognose haben; weniger als 30% der Frauen am Leben sind 5 Jahre nach der Diagnose. Das Netz ist ein bevorzugter Ort der HGSC Metastasenbildung. Trotz der klinischen Bedeutung dieser Mikroumgebung, bleibt der Beitrag der omentalis Fettgewebe an Eierstockkrebs Progression under. Omentalis Fettgewebe ist ungewöhnlich, dass es als milchige Flecken, die aus B, T enthalten sind, und NK-Zellen, Makrophagen und Vorläuferzellen umgebende dichte Nester von Gefäß bekannten Strukturen enthält. Milchige Flecken spielen eine Schlüsselrolle in den physiologischen Funktionen des Netzes, die für die Peritonealdialyse Homöostase erforderlich sind. Wir haben gezeigt, dass milchige Flecken auch Eierstockkrebs metastasierendem Kolonisierung der Bauchfett, einen wichtigen Schritt in der Entwicklung der Peritonealmetastasen zu fördern. Die Ansätze, die wir entwickelt, um zu bewerten und zu quantifizieren, milchige Flecken in je Hier beschreiben wiritoneal Fett- und studieren ihre funktionellen Beitrag zur Eierstockkrebszell metastasierendem Kolonisierung omentalis Geweben in vivo und ex vivo. Diese Ansätze sind verallgemeinerbar zu zusätzlichen Mausmodellen und Zelllinien, so dass die Studie von Eierstockkrebs Metastasenbildung von der anfänglichen Lokalisierung von Zellen bis milchig Punktstrukturen für die Entwicklung der weit verbreiteten Peritonealmetastasen.

Identifizierung und histologische Untersuchung von Peritoneal Fettdepots Grobe anatomische Präparation ermöglicht die Identifizierung von vier der fünf primären Quellen von peritonealen Fett (1A). Im Uhrzeigersinn von oben in der Mitte sind: das Netz (OM; beschrieben) liegt über dem Magen und Milz, die Gonaden Fett (GF), die den linken Eierstock (OV), die uterine Fett (UF) auf die Uterushörner angebracht (uh) und das Mesenterium (MY) an den Dünndarm (...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose at JoVE.com

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo und ex vivo Ansätze für Eierstockkrebs Metastatische Colonization von Milky Punktstrukturen in Peritoneal Fettgewebe Studieren

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

in-vivo-ex-vivo-approaches-to-study-ovarian-cancer-metastatic

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Medicine

Unit 2

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

Cancer

SCIENTISTS IN ACTION

12.9K Aufrufe.  The University of Chicago. We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Serie: In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

Ex-vivo-Infektion von lebendem Gewebe mit onkolytischen Viren

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Forschung

Medizin

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Ein In Vitro System zur Tumor Vegetationsruhe und die Umstellung auf Metastasen Study

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel Hochauflösende<em&gt; In vivo</em&gt; Bildtechnik, um die Dynamik der intrakranielle Strukturen zu Tumorwachstum und Therapeutics Studieren

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic lesions. Mouse models are an important tool to investigate inflammatory processes in atherogenesis, but these models suffer from the phenotypic and functional differences between the murine and human immune system. In vitro cell experiments are used to specifically evaluate cell type-dependent changes caused by a substance of interest, but culture-dependent variations and the inability to analyze the influence of specific molecules in the context of the inflammatory compound in atherosclerotic lesions limit the impact of the results. In addition, measuring levels of a molecule of interest in human blood helps to further investigate its clinical relevance, but this represents systemic and not local inflammation. Therefore, we here describe a plaque culture model to study human atherosclerotic lesion biology ex vivo. In short, fresh plaques are obtained from patients undergoing endarterectomy or coronary artery bypass grafting and stored in RPMI medium on ice until usage. The specimens are cut into small pieces followed by random distribution into a 48-well plate, containing RPMI medium in addition to a substance of interest such as cytokines or chemokines alone or in combination for defined periods of time. After incubation, the plaque pieces can be shock frozen for mRNA isolation, embedded in Paraffin or OCT for immunohistochemistry staining or smashed and lysed for western blotting. Furthermore, cells may be isolated from the plaque for flow cytometry analysis. In addition, supernatants can be collected for protein measurement by ELISA. In conclusion, the presented ex vivo model opens the possibility to further study inflammatory lesional biology, which may result in identification of novel disease mechanisms and therapeutic targets.

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process. This manuscript illustrates an easy to use ex vivo model to investigate fresh carotid or coronary artery plaques. The ex vivo model allows for the investigation of potential substances on the inflammatory milieu in human atherosclerotic lesions and results can be analyzed by various methods.

A Human<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Atherosklerotischen Plaque Modell zur Läsion Biologie studieren

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Molecular Profiling von der invasiven Tumor-Microenvironment in einem 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells und<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Fibroblasten

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

Validierung der Nanobody und Antikörper-basierte<em&gt; In-vivo-</em&gt; Tumorxenotransplantat NIRF-Bildgebung Experimente bei Mäusen verwenden<em&gt; Ex vivo</em&gt; Durchflusszytometrie und Mikroskopie

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

Menschen Dupuytren&#39;sche<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur für das Studium der Myofibroblasten und extrazellulären Matrix-Interaktionen

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Intrauterine Telemetrie zur Maus Kontraktionsdruck messen<em&gt; In-vivo-</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...