Diese Methode ermöglicht ein besseres Verständnis der strukturellen Organisationen von Glykogenpartikeln. Es ist ein wichtiges Thema, weil die Population der Glucan-Ketten, die sogenannte Kettenlängenverteilung, die physikalischen chemischen Eigenschaften der Glykogenpartikel bestimmt. Wie z.B. Wasserlöslichkeit.
Ein großer Vorteil dieser Technik ist, dass die Fluoreszenz unabhängig von der Glucan-Kettenlänge konstant ist. Es gibt nur ein APTS-Molekül, das durch Glucan gebunden ist. Somit ist die Fluoreszenzintensität direkt proportional zur Anzahl der Glucan-Ketten.
Das Gebiet der assistierten Kapillarelektrophorese eignet sich zur Lösung des medizinischen Mechanismus von Glykogenmetabolisierungsenzymen. Zum Beispiel können wir den Grad der Polymerisation von Glucan-Ketten bestimmen, die durch Verzweigen von Enzymen auf akzeptiertes Glucan übertragen werden. Die Reaktion muss unter Bedingungen durchgeführt werden.
Daher müssen Regionen vor Feuchtigkeit geschützt werden. Mischen Sie 200 Mikroliter 0,5-2 Milligramm pro Milliliter gereinigtes Glykogen mit 200 Mikrolitern 100 Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 4,8. Fügen Sie 2 Mikroliter Isoamylase und 1,5 Mikroliter Pullulanase hinzu.
Vorsichtig durch Pipettieren auf und ab mischen. Dann bei 42 Grad Celsius für 16 Stunden in einem 1,5-Milliliter-Rohr inkubieren. Stoppen Sie die Reaktionen, indem Sie bei 95 Grad Celsius für 5 Minuten inkubieren.
Zentrifugieren Sie bei 16, 100 mal G'für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um unlösliches Material zu pelletieren und zu entfernen. Entfernen Sie die Superwartung mit einer Pipette und übertragen Sie sie auf neue kommentierte Rohre. Nach Zugabe von Harzperlen in ein leeres Mikrofugenröhrchen entsalzen Sie die Überstände, indem Sie das Äquivalent von 100 Mikrolitern eines Anionenkationenaustauschharzes hinzufügen und rühren.
Sammeln Sie die Proben durch Pipettieren und legen Sie sie in neue kommentierte Röhrchen. Gefriertrocknen Sie die Proben. Lagern Sie getrocknete Proben bei Raumtemperatur oder 20 Grad Celsius.
Mischen Sie die getrockneten Proben mit 2 Mikrolitern 1 molaren Natriumcyanoborhydrid und Tetrahydrofuran und 2 Mikrolitern 8 Amino 1-3-6 Pyrentrisulfonsäure. Bei 42 Grad Celsius 16 Stunden im Dunkeln inkubieren. Geben Sie 46 Mikroliter Reinstwasser zu jeder Probe.
Um die Proben 50 Mal zu verdünnen, fügen Sie einen Mikroliter der Probe zu 49 Mikrolitern Reinstwasser in 100-Mikroliter-Mikrofläschchen hinzu. Im Wirbel, um gründlich zu mischen. Legen Sie die Proben für 5 bis 10 Minuten ins Dunkel, während Sie das Gesicht einstellen.
Um eine Elektrophorese mit umgekehrter Polarität durchzuführen, richten Sie die Methode ein und stellen Sie den Einspritzdruck auf 0,5 Pfund Kraft pro Quadratzoll ein. Stellen Sie dann die Polarität für die Trennung in den umgekehrten Modus ein. Verdünnen Sie den N-verknüpften Kohlenhydrat-Trennpuffer in Reinstwasser auf ein Drittel.
Führen Sie die APTS-gekennzeichnete Glucan-Trennung im verdünnten Puffer bei 30 Kilovolt in einer blanken Quarzglaskapillare durch. Richten Sie dann die Injektionszeit ein und starten Sie die Analyse. Exportieren Sie die ASC- und CDF-Dateien, die das Elektropherogrammprofil bzw. die Integrationsdaten enthalten.
Öffnen Sie die ASC-Datei und zeichnen Sie die relative Fluoreszenzeinheit gemäß dem Zeitdiagramm. Öffnen Sie die Datei CDF. Fahren Sie mit einer ersten automatischen Integration fort und passen Sie die folgenden Parameter mit Tal-zu-Tal-Integration und Mindestfläche an.
Überprüfen und korrigieren Sie jedes fehlerhafte Integrationsereignis manuell. Die zwischen 4,13 und 4,67 Minuten beobachteten Fluoreszenzsignale stammten von den nicht reagierenden APTS. Die Aleutenzeit des markierten Maltohexaose DP 6 wurde auf 8,49 Minuten geschätzt.
Die mit APTS gekennzeichneten Glucane aus Rinderglykogen wurden anhand der Aleutenzeit von DP 6 identifiziert. In der Kontrollprobe, in der Glykogen nicht mit abzweigenden Enzymen inkubiert wurde, wurde keine Spur von freiem Maltooligosaccharid nachgewiesen. Das Inset-Panel zeigt eine Trennung von Glucan-Ketten bis zu 44 DP. Die Kettenlängenverteilung wird als Prozentsatz der DP für jede DP angezeigt. Die durchschnittliche Kettenlänge wurde berechnet, indem jeder Prozentsatz der Kette mal den entsprechenden Polymerisationsgrad summiert wurde.
Gesichtsanalysen zeigten, dass die am häufigsten vorkommenden Glucane Maltose- und Kaninchenleber, Maltohexaose in der Auster und Maltoheptaose in der Rinderleber sind. Die Kettenlängenverteilungen von Glykogen, das von Wildtyp- und mutierten Cyanobakterienstämmen gereinigt wurde, wurden mittels Gesichtsanalyse bestimmt. Subtraktive Analysen wurden durchgeführt, indem der Prozentsatz jedes DP des Wildtyps vom Prozentsatz jedes DP der Mutanten subtrahiert wurde.
Die durchschnittlichen Kettenlängenverteilungen von Glykogen aus Wildtypen und Mutanten von Synechocystis wurden entsprechend dem für jede CLD beobachteten maximalen Peak normalisiert. Diese Technik ermöglicht ein besseres Verständnis menschlicher Krankheiten, die mit einem Defekt im Glykogenstoffwechsel verbunden sind, insbesondere der Andersen-Krankheit, reiche Ergebnisse aus der Ansammlung abnormaler Glykogenpartikel in Zellen.
