Name: determination of the glycogen content in cyanobacteria
Uploaded: 2017-07-17T15:00:00.000+00:00
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Die Autoren bestätigen die nordische Energieforschung (AquaFEED, Projekt Nr. 24), Innovationfonden Dänemark (Pant Power, Projekt Nr. 12-131844) und Villum Fonden (Projekt Nr. 13363)

1. Vorbereitung <ol><li> Cyanobakterielle Kulturen <ol><li> Wachsen Synechocystis sp. PCC 6803 bei 30 ° C in flüssigem BG11-Medium 8 , mit einer konstanten Luftzufuhr, ergänzt mit 1% (V / V) CO 2 . Beleuchten Sie die Kulturen kontinuierlich mit Licht bei einer photosynthetischen Photonenflussdichte von 50 μmol Photon / m 2 / s. </li><li> Wachsen Synechococcus sp. PCC 7002 in flüssigem A + Medium 23 (BG11-Medium kann auch verwendet werden), mit einer konstanten Luftzufuhr, ergänzt mit 1% (V / V) CO 2 . Die Temperatur sollte 37 ° C betragen. Beleuchten Sie die Kulturen kontinuierlich mit Licht bei einer photosynthetischen Photonenflussdichte von 150 μmol Photon / m 2 / s. </li><li> Messen Sie die optische Dichte (OD) der Kultur bei 730 nm mit einer Küvette mit einem Lichtweg von 1 cm. Wenn der OD-Wert über 0,8 liegt, machen Sie entsprechende Verdünnungen, um OD-Messungen zu erhalten, die proportional zu th sindE Zellkonzentration HINWEIS: Die unten dargestellten Protokolle sind für Flüssigkulturen geeignet, wobei eine Zelldichte einem OD 730nm- Wert von 2 oder höher entspricht. Wenn Kulturen in der exponentiellen Wachstumsphase erwünscht sind, die typischerweise einen OD 730nm- Wert unter 1 haben, konzentrieren sie die Zelldichte durch Zentrifugation und Resuspension in einem Puffer oder Medium, um einen OD 730nm- Wert von 2 oder höher zu erreichen. </li></ol></li><li> Puffer und Reagenzien <ol><li> Machen Sie 50 mM Tris-HCl-Puffer bei pH 8. </li><li> Mischen Sie 50 mM Natriumacetatpuffer bei pH 5. </li><li> Eine Stammlösung von 8 U / ml Amyloglucosidase in 50 mM Natriumacetatpuffer, pH 5, herstellen. </li><li> Eine Stammlösung von 2 U / ml α-Amylase in 50 mM Natriumacetatpuffer, pH 5, herstellen. </li><li> Unter Verwendung von destilliertem Wasser werden Glukose-Standardlösungen in Konzentrationen zwischen 0 und 100 μg / ml, hergestellt. </li><li> GOD-POD-Reagenz aus dem D-Glucose-Assay-Kit (GODPOD-Format) vorbereiten, fDer Anweisung des Herstellers. </li></ol></li></ol> 2. Bestimmung des Zell-Trockengewichts (optional) <ol><li> Übertragen Sie 2 ml einer Kultur oder einer Zellresuspension (siehe Schritt 1.1) auf ein 2,0 ml Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 6000 xg und 4 ° C für 5 min. Den Überstand verwerfen. </li><li> Das Pellet in 1 ml Wasser resuspendieren und 5 min bei 6000 xg und 4 ° C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das Zellpellet in 0,5 ml Wasser resuspendieren. </li><li> Übertragen Sie die Aufhängung auf eine vorgewogene Aluminiumschale. Übertragen Sie das Tablett auf einen Trockenofen bei 105 ° C für Übernachttrocknung (ca. 18 h). KRITISCH: Es ist wichtig, dass das Tablett mit einer Pinzette gehandhabt wird, um die Übertragung von Material von den Fingern zu vermeiden. Trocknen Sie eine leere, vorgewogene Aluminium-Schale unter den gleichen Bedingungen, um jeden Gewichtsverlust aus den Schalen während des Trocknens zu bestimmen. </li><li> Nach dem Trocknen entfernen Sie das Tablett aus dem Ofen und lassen Sie es bei Umgebungsbedingungen ausgleichenOns für 5 min vor dem Wiegen mit einer Genauigkeit von 0,0001 g. HINWEIS: Der Wert kann verwendet werden, um den Glykogengehalt auf einer Zell-Trockengewichtsbasis zu normalisieren. </li></ol> 3. Lyse von Cyanobakterienzellen <ol><li> 1 ml einer Kultur oder einer Zellresuspension (siehe Schritt 1.1) in ein 1,5 mL Röhrchen überführen und bei 6000 xg und 4 ° C für 10 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen. </li><li> Das Pellet wird in 1 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8 resuspendiert und bei 6000 xg und 4 ° C für 10 min zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml des Tris-HCl-Puffers. Wiederholen Sie den Vorgang. </li><li> Das Pellet in 500 μl 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8, sorgfältig resuspendieren. CRITICAL: Das Pellet gut für eine effiziente Zelllyse resuspendieren. Halten Sie die Resuspension in Eis. </li><li> Lyse die resuspendierten Zellen bei 4 ° C durch Durchführen von 30 Zyklen der Ultraschallbehandlung, wobei jeder Zyklus aus 30 s bei einer Frequenz von 20 kHz mit der maximalen Amplitude besteht,Gefolgt von 90 s ohne. HINWEIS: Diese Methode kann Synechococcus sp. PCC 7002 <ol><li> Alternativ können Sie die Zelle Resuspension auf ein Schraubverschlussrohr übertragen und Zirkonoxidperlen dem Rohr nach den Anweisungen des Herstellers zugeben. Setzen Sie den Schlauch in einen Gewebehomogenisator und lysieren Sie die Zellen bei 4 ° C, indem Sie 2 Zyklen des Schlagens ausführen, wobei jeder Zyklus aus 5 min bei der Frequenzeinstellung von 5 besteht. HINWEIS: Diese Methode kann Synechocystis sp. PCC 6803 und Synechococcus sp. PCC 7002 </li></ol></li><li> Das Röhrchen, das das Lysat enthält, für 10 min bei 6000 xg und 4 ° C zentrifugieren. HINWEIS: Das Pellet sollte hauptsächlich aus großen Zelltrümmer bestehen. Wenn es eine beträchtliche Anzahl von ununterbrochenen Zellen gibt, wiederholen Sie Schritt 3.4. Halten Sie den Überstand auf Eis. </li><li> Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem kommerziellen BCA Protein Assay Kit. HINWEIS: Der Wert kann verwendet werden, um den Glykogengehalt zu normalisierenAuf Proteininhaltsbasis. </li></ol> 4. Glykogen Niederschlag <ol><li> Entfernen Sie Chlorophyll a aus dem Zelllysat durch Mischen von 900 μl 96% (v / v) Ethanol und 100 μl des Überstandes aus Schritt 3.5 in einem 1,5 mL Schraubverschlussrohr. Nach dem Schließen der Kappe das Röhrchen bei 90 ° C für 10 min mit einem Standard-Laborheizblock erhitzen. </li><li> Inkubieren Sie die Röhre auf Eis für 30 min. </li><li> Das Röhrchen bei 20.000 xg und 4 ° C für 30 min zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen; Das Pellet enthält Glykogen. Das Pellet in der Luft trocknen, um überschüssiges Ethanol zu entfernen. KRITISCH: Eine übermäßige Trocknung des Pellets muss vermieden werden, sonst wird es in Schritt 5.1 schwer zu lösen. </li><li> OPTIONAL: die Absorption des in Schritt 4.3 bei 664 nm erhaltene Überstand misst die Chlorophyll - a - Gehalt zu bestimmen. Verwenden Sie einen Absorptionskoeffizienten von 84,6 L / g / cm 24 . HINWEIS: Der Wert kann zum Normalisieren verwendet werdenE der Glykogengehalt </li></ol> 5. Enzymatische Hydrolyse und Glykogenbestimmung <ol><li> Das in Schritt 4.3 erhaltene Pellet in 100 &amp; mgr; l 50 mM Natriumacetat, pH 5, löst und 50 &amp; mgr; l 8 U / ml Amyloglucosidase und 50 &amp; mgr; l 2 U / ml α-Amylase zugeben. Mischen Sie diese Materialien gut mit einem Wirbel. HINWEIS: Das Mischen durch Pipettieren wird nicht empfohlen, da das Glykogenpellet viskos ist. </li><li> Inkubieren Sie die Mischung bei 60 ° C auf einem Heizblock für 2 h, um die Verdauung von Glykogen in Glukosemoleküle zu ermöglichen. </li><li> Die Probe bei 10.000 xg für 5 min zentrifugieren und den Überstand in ein neues 1,5 ml Röhrchen überführen. </li></ol> 6. Bestimmung des Gesamtglukosegehalts unter Verwendung des GOD-POD-Reagens <ol><li> Messen Sie die Konzentration von Glukose in dem in Schritt 5.3 erhaltenen Überstand unter Verwendung des GOD-POD-Reagenzes. Übertragen Sie 100 &amp; mgr; l des Überstandes von Schritt 5.3 zu einer Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen. Als Negativkontrolle,100 μl 50 mM Natriumacetat, pH 5 verwenden. Zur Erzeugung einer Eichkurve werden auch die Glucose-Standardlösungen gemessen. </li><li> Füge 150 μl GOD-POD-Reagenz zu jeder Probe hinzu und vermische mich schnell durch Pipettieren. </li><li> Inkubieren Sie die Platte statisch bei 25 ° C für 30 min. Den Extinktionswert bei 510 nm mit einem Plattenleser aufzeichnen. </li><li> Berechnen Sie die Konzentration von Glukose mit einer Eichkurve, die aus den Glukosestandards erhalten wird. HINWEIS: Die Glykogenkonzentration im Zelllysat wird als Konzentration von Glucose (μg / ml) ausgedrückt. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls sind Glykogenpräzipitation und Resuspension. Nach der Zentrifugation nach Ethanol-Präzipitation bildet Glykogen ein lichtdurchlässiges Pellet, das lose an den Wänden der Mikrozentrifugenröhrchen haftet. Daher muss beim Entfernen des Überstandes besondere Aufmerksamkeit gegeben werden, um das Pellet nicht zu entfernen. Das Glykogen-Pellet ist klebrig, und Solubilisierung kann schwierig sein, wenn es austrocknet. Man beachte, daß die vollständige Solubilisierung des Glyk...

Cyanobakterien akkumulieren Glykogen als den Hauptkohlenhydratspeicher von Kohlenstoff aus CO 2, der durch Lichtsynthese in Licht fixiert ist. Glykogen ist ein Glycan, bestehend aus linearem α-1,4-verknüpften Glucan mit Verzweigungen, die durch α-1,6-verknüpfte Glucosyl-Bindungen erzeugt werden. Die Glykogen-Biosynthese in Cyanobakterien beginnt mit der Umwandlung von Glucose-6-phosphat in ADP-Glucose durch die sequentielle Wirkung von Phosphoglucomutase und ADP-Glucose-Pyrophosphorylase. Der Glucoseanteil in ADP-Glucose wird auf das nicht-reduzierende Ende des α-1,4-Glucan-Grundgerüsts von Glykogen durch eine oder mehrere Glykogensynthasen (GlgA) übertragen. Anschließend führt eine Verzweigungsenzyme die α-1,6-verknüpfte Glucosylbindung ein, die weiter ausgedehnt wird, um das Glykogenteilchen zu erzeugen. Im Dunkeln wird Glykogen durch Glykogenphosphorylase, Glykogen-Entzweigungsenzyme, α-Glucanotransferase und Malto-Dextrin-Phosphorylase in phosphorylierte Glukose und freie Glukose abgebaut. Diese FuttermittelO katabolische Wege, einschließlich des oxidativen Pentose-Phosphat-Weges, des Embden-Meyerhof-Parnas-Weges (Glykolyse) und des Entner-Doudoroff-Weges 1 , 2 , 3 , 4 . Der Glykogen-Metabolismus in Cyanobakterien hat in den letzten Jahren zunehmend Interesse geweckt, weil Cyanobakterien die Möglichkeit haben, sich in mikrobielle Zellfabriken zu entwickeln, die von Sonnenlicht angetrieben werden, um Chemikalien und Kraftstoffe herzustellen. Der Glykogen-Stoffwechsel könnte modifiziert werden, um die Ausbeute der Produkte zu erhöhen, da Glykogen der größte flexible Kohlenstoff-Pool in diesen Bakterien ist. Ein Beispiel ist das Cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, das genetisch hergestellt wurde, um Mannit zu produzieren; Die genetische Störung der Glykogensynthese erhöht die Mannit-Ausbeute 3-fach 5 . Ein weiteres Beispiel ist die Herstellung von Bioethanol aus Glykogen-beladenem WildtYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 Der Wildtyp-Zell-Glykogengehalt kann bis zu 60% des Trockengewichts der Zelle während des Stickstoff-Verhungerns 6 betragen. Unser Verständnis von Glykogenstoffwechsel und Regulierung hat sich auch in den letzten Jahren erweitert. Während Glykogen bekannt ist, sich im Licht zu akkumulieren und im Dunkeln zu kalibrieren, wurde die detaillierte Kinetik des Glykogenstoffwechsels während des Diel-Zyklus erst vor kurzem in Synechocystis sp. PCC 6803 7 . Darüber hinaus wurden mehrere Gene, die die Akkumulation von Glykogen beeinflussen, identifiziert. Ein bemerkenswertes Beispiel ist die Entdeckung, dass die mutmaßliche Histidinkinase PmgA und die nicht-kodierende RNA PmgR1 eine regulatorische Kaskade bilden und die Akkumulation von Glykogen kontrollieren. Interessanterweise sammeln die pmgA- und pmgR1- Deletionsmutanten doppelt so viel Glykogen wie der Wildtyp-Stamm von Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 Es sind auch andere regulatorische Elemente bekannt, die die Akkumulation von Glykogen beeinflussen, einschließlich des alternativen Sigma-Faktors E und des Transkriptionsfaktors CyAbrB2 10 , 11 . Da das Interesse an der Glykogenregulation und dem Metabolismus zunimmt, ist ein detailliertes Protokoll, das die Bestimmung des Glykogengehalts beschreibt, gerechtfertigt. In der Literatur werden mehrere Methoden angewendet. Säurehydrolyse, gefolgt von der Bestimmung des Monosaccharidgehalts durch Hochdruck-Anionenaustausch-Flüssigkeitschromatographie, gekoppelt mit einem gepulsten amperometrischen Detektor oder spektrometrische Bestimmung nach Behandlungen mit Säure und Phenol, sind weit verbreitete Verfahren zur Annäherung des Glykogengehalts 9 , 10 , 12 , 13 . Allerdings ist ein Hochdruck-Anionenaustausch Flüssigkeit ChromatographieC-Instrument ist sehr teuer und unterscheidet nicht Glukose, die aus Glykogen stammt, aus jener, die von anderen glucosehaltigen Glycokonjugaten abgeleitet ist, wie Saccharose 14 , Glucosylglycerin 15 und Cellulose 16 , 17 , 18 , von denen bekannt ist, dass sie sich in einigen Cyanobakterienarten ansammeln. Das Säure-Phenol-Verfahren kann mit Standard-Laborgeräten durchgeführt werden. Allerdings verwendet es hochgiftige Reagenzien und unterscheidet nicht Glukose, die von verschiedenen Glycokonjugaten abgeleitet ist, noch unterscheidet es Glukose von anderen Monosacchariden, die zelluläre Materialien wie Glykolipide, Lipopolysaccharide und extrazelluläre Matrizen bilden 12 . Bemerkenswerterweise wird der heiße Säure-Phenol-Assay häufig für die Bestimmung des Gesamtkohlenhydratgehaltes und nicht für die spezifische Bestimmung des Glukosegehalts 12 verwendet . Enzymatische hyDie drolyse von Glykogen zu Glucose durch α-Amyloglucosidase, gefolgt von dem Nachweis von Glukose durch einen enzymgekoppelten Assay, erzeugt eine kolorimetrische Auslesung, die hochempfindlich und spezifisch für Glukose ist, die aus Glykogen gewonnen wird. Die Spezifität kann mit der bevorzugten Ausfällung von Glykogen aus Zelllysaten durch Ethanol 5 , 8 , 19 weiter verstärkt werden . Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für einen Enzym-basierten Assay des Glykogengehalts in zwei der am meisten untersuchten Cyanobakterienarten Synechocystis sp. PCC 6803 und Synechococcus sp. PCC 7002, im Wildtyp und Mutantenstämme. Um eine effiziente Hydrolyse zu gewährleisten, wird ein Cocktail aus α-Amylase und α-Amyloglucosidase verwendet 8 . Die endo-wirkende α-Amylase hydrolysiert die α-1,4-Bindungen in verschiedenen Glucanen in Dextrine, die weiter hydrolysiert werdenO Glucose durch exo-aktive α-Amyloglucosidase 20 . Die synergistischen Wirkungen dieser Enzyme sind bekannt, und diese Enzyme werden routinemäßig für die selektive Hydrolyse von Stärke verwendet, die ein α-verknüpftes Glucan wie Glykogen ist, ohne andere Glycokonjuganten wie Cellulose in der Pflanzenbiomasse 21 zu beeinflussen . Die freigesetzte Glukose wird nach einem enzymgekoppelten Assay, bestehend aus Glucoseoxidase, quantifiziert, der die Reduktion von Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid und die Oxidation von Glucose zu einer Lacton- und Peroxidase katalysiert, die einen rosafarbenen Chinoniminfarbstoff aus Wasserstoffperoxid, Eine phenolische Verbindung und 4-Aminoantipyrin 22 .

<table><tbody><tr><td>QSonica Sonicators Q700</td><td>Qsonica, LLC</td><td>NA</td><td>QSonica</td></tr><tr><td>SpectraMax 190 Microplate Reader&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>NA</td><td>Eliza plate reader</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm</td><td>Next Advance</td><td>BBY24M-CE</td><td>Beads beater</td></tr><tr><td>Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer</td><td>Amersham Biosciences</td><td>NA</td><td>Spectrophotometer</td></tr><tr><td>Tris&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>1-00317</td><td>pH adjutment</td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32319</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>Amyloglycosidase (Rhizopus sp.)</td><td>Megazyme</td><td>E-AMGPU</td><td>Enzyme for glycogen depolymerization</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3176</td><td>Enzyme for glycogen depolymerization</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Merch</td><td>8337</td><td>Standard for the glucose assay</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein assay kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>23225</td><td>For determination of protein concentrations</td></tr><tr><td>Aluminum drying trays, disposable</td><td>VWR</td><td>611-1362</td><td>For determination of cell dry weights</td></tr><tr><td>D-Glucose assay kit (GODPOD format)</td><td>Megazyme</td><td>K-GLUC</td><td>For determination of glucose concentrations</td></tr><tr><td>Zirconium oxide breads, 0.15 mm</td><td>Next Advance</td><td>ZrOB015</td><td>Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm</td></tr><tr><td>RINO tubes</td><td>Next Advance</td><td>NA</td><td>Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm</td></tr></tbody></table>

determination of the glycogen content in cyanobacteria

Cyanobakterien akkumulieren Glykogen als eine wichtige intrazelluläre Kohlenstoff- und Energiespeicherung während der Photosynthese. Die jüngsten Entwicklungen in der Forschung haben komplexe Mechanismen des Glykogenstoffwechsels hervorgehoben, einschließlich des Diel-Zyklus der Biosynthese und des Katabolismus, der Redoxregulation und der Beteiligung von nicht-kodierender RNA. Gleichzeitig werden Anstrengungen unternommen, um Kohlenstoff von Glykogen zu wünschenswerten Produkten in gentechnisch veränderten Cyanobakterien umzuleiten, um die Produktausbeuten zu erhöhen. Mehrere Methoden werden verwendet, um den Glykogengehalt in Cyanobakterien mit variablen Genauigkeiten und technischen Komplexitäten zu bestimmen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die zuverlässige Bestimmung des Glykogengehalts in Cyanobakterien zur Verfügung, die in einem Standard-Life-Science-Labor durchgeführt werden können. Das Protokoll beinhaltet die selektive Ausfällung von Glykogen aus dem Zelllysat und die enzymatische Depolymerisation von Glykogen zur Erzeugung von Glucose-Monomeren, die durch einen Glukoseoxyd nachgewiesen werdenIdase-Peroxidase (GOD-POD) enzymgekoppelter Assay. Die Methode wurde auf Synechocystis sp. PCC 6803 und Synechococcus sp. PCC 7002, zwei Modell-Cyanobakterienarten, die in der Stoffwechseltechnik weit verbreitet sind. Darüber hinaus zeigte das Verfahren erfolgreich Unterschiede in den Glykogeninhalten zwischen dem Wildtyp und Mutanten, die in regulatorischen Elementen oder Glykogen-Biosynthesegenen defekt sind.

10 ml Wildtyp- Synechocystis sp. PCC 6803 wurden unter photochotrophischen Bedingungen gezüchtet, bis der OD 730nm Wert etwa 0,8 erreichte. Die Zellen wurden geerntet und in 50 mM Tris-HCl, pH 8, resuspendiert. Der OD 730nm- Wert wurde auf 2-3 eingestellt. Der Glykogengehalt wurde nach dem oben beschriebenen Protokoll analysiert. Der Glykogengehalt pro OD 730 nm betrug 13 ± 1,8 μg / mL / OD 730 nm ( N = 12). Die Glykogen - ...

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Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Hier stellen wir einen zuverlässigen und einfachen Assay vor, um den Glykogengehalt in Cyanobakterienzellen zu messen. Das Verfahren beinhaltet die Ausfällung, die selektierbare Depolymerisation und den Nachweis von Glukoseresten. Diese Methode eignet sich sowohl für Wildtyp- als auch für gentechnisch veränderte Stämme und kann das metabolische Engineering von Cyanobakterien erleichtern.

Bestimmung des Glykogengehalts in Cyanobakterien

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

determination-of-the-glycogen-content-in-cyanobacteria

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.9K Aufrufe.  Carlsberg Research Laboratory.  Hier stellen wir einen zuverlässigen und einfachen Assay vor, um den Glykogengehalt in Cyanobakterienzellen zu messen. Das Verfahren beinhaltet die Ausfällung, die selektierbare Depolymerisation und den Nachweis von Glukoseresten. Diese Methode eignet sich sowohl für Wildtyp- als auch für gentechnisch veränderte Stämme und kann das metabolische Engineering von Cyanobakterien erleichtern. 

Serie: Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are the most important components of phycobilisomes, the major light-harvesting antennae in cyanobacteria and several algae taxa. The phycobilisomes of Synechocystis contain two phycobiliproteins: phycocyanin and allophycocyanin. This protocol describes a simple, efficient, and reliable method for the quantitative determination of both phycocyanin and allophycocyanin in this model cyanobacterium. We compared several methods of phycobiliprotein extraction and spectrophotometric quantification. The extraction procedure as described in this protocol was also successfully applied to other cyanobacteria strains such as Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., and Nostoc sp., as well as to red algae Porphyridium cruentum. However, the extinction coefficients of specific phycobiliproteins from various taxa can differ and it is, therefore, recommended to validate the spectrophotometric quantification method for every single strain individually. The protocol requires little time and can be performed in any standard life science laboratory since it requires only standard equipment.

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Here, we present a protocol to quantitatively determine phycobiliprotein content in the cyanobacterium Synechocystis using a spectrophotometric method. The extraction procedure was also successfully applied to other cyanobacteria and algae strains; however, due to variations in pigment absorption spectra, it is necessary to test the spectrophotometric equations for each strain individually.

Photometrische Bestimmung des Cyanobakteriums Synechocystis Phycobiliprotein Inhalt

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Forschung

Biochemie

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

Erkennen von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen mit Perjodsäure-Schiff-Färbung

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Immunologie und Infektion

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains of &#945;1,4-linked glucose residues with branches introduced through the addition of &#945;1,6-linkages. Understanding how the synthesis and degradation of glycogen are regulated and how glycogen attains its characteristic branched structure requires the study of the enzymes of glycogen storage. However, the methods most commonly used to study these enzyme activities typically employ reagents or techniques that are not available to all investigators. Here, we discuss a battery of procedures that are technically simple, cost-effective, and yet still capable of providing valuable insight into the control of glycogen storage. The techniques require access to a spectrophotometer, operating in the range of 330 to 800 nm, and are described assuming that the users will employ disposable, plastic cuvettes. However, the procedures are readily scalable and can be modified for use in a microplate reader, allowing highly parallel analysis.

Techniques to measure the activity of key enzymes of glycogen metabolism are presented, using a simple spectrophotometer operating in the visible range.

Spektrophotometrische Methoden zur Untersuchung des eukaryotischen Glykogenstoffwechsels

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are influenced by its structure. Hence, a suitable extraction method that isolates representative samples of glycogen is crucial to the study of this macromolecule. Compared to other extraction methods, a method that employs a sucrose density gradient centrifugation step can minimize molecular damage. Based on this method, a recent publication describes how the density of the sucrose solution used during centrifugation was varied (30%, 50%, 72.5%) to find the most suitable concentration to extract glycogen particles of a wide variety of sizes, limiting the loss of smaller particles. A 10 min boiling step was introduced to test its ability to denature glycogen degrading enzymes, thus preserving glycogen. The lowest sucrose concentration (30%) and the addition of the boiling step were shown to extract the most representative samples of glycogen.

An optimal sucrose concentration was determined for the extraction of liver glycogen using sucrose density gradient centrifugation. The addition of a 10 min boiling step to inhibit glycogen-degrading enzymes proved beneficial.

Die Extraktion von Leberglykogenmolekülen zur Glykogenstrukturbestimmung

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This enables quantifications of ultrastructural aspects such as volume fractions, surface area to volume ratios, morphometry, and physical contact sites of different subcellular structures. In the 1970s, a protocol for enhanced staining of glycogen in cells was developed and paved the way for a string of studies on the subcellular localization of glycogen and glycogen particle size using transmission electron microscopy. While most analyses interpret glycogen as if it is homogeneously distributed within the muscle fibers, providing only a single value (e.g., an average concentration), transmission electron microscopy has revealed that glycogen is stored as discrete glycogen particles located in distinct subcellular compartments. Here, the step-by-step protocol from tissue collection to the quantitative determination of the volume fraction and particle diameter of glycogen in the distinct subcellular compartments of individual skeletal muscle fibers is described. Considerations on how to 1) collect and stain tissue specimens, 2) perform image analyses and data handling, 3) evaluate the precision of estimates, 4) discriminate between muscle fiber types, and 5) methodological pitfalls and limitations are included.

A modified post-fixation procedure increases the contrast of glycogen particles in tissue. This paper provides a step-by-step protocol describing how to handle the tissue, conduct the imaging, and use stereological methods to obtain unbiased and quantitative data on fiber type-specific subcellular glycogen distribution in skeletal muscle.

Quantifizierung der subzellulären Glykogenverteilung in Skelettmuskelfasern mittels Transmissionselektronenmikroskopie

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached to each other by &#945;-1,6 glucoside linkages, referred to as branch points. Among the different forms of carbon storage (i.e., starch, &#946;-glucan), glycogen is probably one of the oldest and most successful storage polysaccharides found across the living world. Glucan chains are organized so that a large amount of glucose can quickly be stored or fueled in a cell when needed. Numerous complementary techniques have been developed over the last decades to solve the fine structure of glycogen particles. This article describes Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE). This method quantifies the population of glucan chains that compose a glycogen particle. Also known as chain length distribution (CLD), this parameter mirrors the particle size and the percentage of branching. It is also an essential requirement for the mathematical modeling of glycogen biosynthesis.

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

In the present protocol, the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) technique is used to determine the chain length distribution (CLD) and the average chain length (ACL) of glycogen.

Bestimmung der Glucankettenlängenverteilung von Glykogen mit der Fluorophor-gestützten Kohlenhydratelektrophorese-Methode (FACE)

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

Biochemische Titration von Glykogen<em&gt; In-vitro-</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Biologie

A Non-Degradative Extraction Method for Molecular Structure Characterization of Bacterial Glycogen Particles

Currently, there exist a variety of glycogen extraction methods, which either damage glycogen spatial structure or only partially extract glycogen, leading to the biased characterization of glycogen fine molecular structure. To understand the dynamic changes of glycogen structures and the versatile functions of glycogen particles in bacteria, it is essential to isolate glycogen with minimal degradation. In this study, a mild glycogen isolation method is demonstrated by using cold-water (CW) precipitation via sugar density gradient ultra-centrifugation (SDGU-CW). The traditional trichloroacetic acid (TCA) method and potassium hydroxide (KOH) method were also performed for comparison. A commonly used lab strain, Escherichia coli BL21(DE3), was used as a model organism in this study for demonstration purposes. After extracting glycogen particles using different methods, their structures were analyzed and compared through size exclusion chromatography (SEC) for particle size distribution and fluorophore-assisted capillary electrophoresis (FACE) for linear chain length distributions. The analysis confirmed that glycogen extracted via SDGU-CW had minimal degradation.

Bacterial glycogen structure is greatly impacted by extraction methods which may result in molecular degradation and/or biased sampling. It is essential to develop methods to minimize these problems. Here, four extraction methods have been compared using size distribution and chain length distribution as key criteria for minimizing extraction artifacts.

Currently, there exist a variety of glycogen extraction methods, which either damage glycogen spatial structure or only partially extract glycogen, ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. Studying the structure and composition of phycobilisome is of great interest to scientists because it reveals the evolution and divergence of photosynthesis in cyanobacteria. This protocol provides a detailed and optimized method to break cyanobacterial cells at low cost by a bead-beater efficiently. The intact phycobilisome can then be isolated from the cell extract by sucrose gradient ultracentrifugation. This method has demonstrated being suitable for both model and non-model cyanobacteria with different cell types. A step-by-step procedure is also provided to confirm the integrity and property of phycobiliproteins by 77K fluorescence spectroscopy and SDS-PAGE stained by zinc sulfate and Coomassie Blue. The isolated phycobilisome can also be subjected to further structural and compositional analyses. Overall, this protocol provides a helpful starting guide that allows researchers unfamiliar with cyanobacteria to quickly isolate and characterize intact phycobilisome.

The current protocol details the isolation of phycobilisomes from cyanobacteria by centrifugation through a discontinuous sucrose density gradient. The fractions of intact phycobilisomes are confirmed by 77K fluorescent emission spectrum and SDS-PAGE analysis. The resulting phycobilisome fractions are suitable for negative staining of TEM and mass spectrometry analysis.

Isolierung und Charakterisierung intakter Phycobilisomen in Cyanobakterien

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Glycogen Branching Assay to Measure the Degree of Glycogen Branching

Source: Wilson, W. A., <a href="https://app.jove.com/v/63046">Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism.</a> J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we describe a qualitative spectrophotometric assay to determine the extent of branching in a glycogen sample with an uncharacterized structure. Comparing the absorbance maxima of the uncharacterized sample with that of polysaccharides with known branched structures indicates the presence of branching in the uncharacterized sample.

Glykogenverzweigungsassay zur Messung des Grades der Glykogenverzweigung

Source: Wilson, W. A., Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism. J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we describe a ...