Die Protokolle sind von Bedeutung, weil sie die Verwendung radioaktiver Isotope vermeiden und eine Barriere beseitigen, die viele Arbeiter daran hindern kann, Enzyme des Glykogenstoffwechsels zu untersuchen. Die beschriebenen Verfahren sind kostengünstig und erfordern nur den Zugang zu einem einfachen Spektralphotometer. Um mit der Bestimmung der Glykogensynthaseaktivität zu beginnen, tauen Sie die zuvor hergestellten Stammlösungen von UDP-Glucose, ATP, Phosphoenolpyruvat und NDP-Kinase auf Eis auf.
Ein Wasserbad auf 30 Grad Celsius vorheizen. Wenn die Stammlösungen fertig sind, ist eine ausreichende Assaymischung entsprechend der Anzahl der Glykogensynthase-Assays herzustellen, indem die Reagenzien in ein 15-Milliliter-Röhrchen gegeben werden, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie eine Blindreaktion vor, indem Sie das NADH aus der Reaktionsmischung durch das Wasser ersetzen, und übertragen Sie die Reaktion auf eine Einweg-Methacrylatküvette.
Verwenden Sie die Blindreaktion, um das Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 340 Nanometern auf Null zu setzen. Nehmen Sie ein Aliquot von 770 Mikrolitern des Reaktionsgemisches in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie nacheinander jeweils zwei Mikroliter NDP-Kinase und Pyruvatkinase-Laktatdehydrogenase-Mischung in das Röhrchen hinzu. Nach dem Mischen das Röhrchen bei 30 Grad Celsius im Wasserbad drei Minuten vorsichtig inkubieren, um das Reaktionsgemisch vorzuwärmen.
Dann werden 30 Mikroliter der Glykogensynthase-haltigen Probe in 20 Millimolar Tris-Puffer bei pH 7,8 gegeben und vorsichtig gemischt, bevor das Reaktionsgemisch in eine Entsorgungsmethacrylatküvette überführt wird. Legen Sie die Küvette in das Spektralphotometer und zeichnen Sie die Absorption bei 340 Nanometern in zeitlichen Intervallen für 10 bis 20 Minuten auf. Zeichnen Sie dann die erhaltenen Absorptionswerte gegen die Zeit auf.
Um die freigesetzte Glukose zu messen, übertragen Sie 40 Mikroliter des Überstands aus den erhitzten Glykogenproben in die Einweg-Methacrylatküvetten. Und fügen Sie die gemessenen Volumina von Triethanolamin, Hydrochlorid-Magnesiumsulfat-Puffer, NADP-ATP-Mischung und Wasser hinzu, wie im Manuskript beschrieben. Mischen Sie die Mischung, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, ohne Luftblasen zu erzeugen.
Fügen Sie 0,5 Mikroliter Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase zu jeder Küvette hinzu. Nach dem Mischen durch Pipettieren die Mischung bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubieren und dann die Absorption bei 340 Nanometern aufzeichnen. Als nächstes mischen Sie 0,5 Mikroliter Hexokinase in jede Küvette, wie zuvor beschrieben, und inkubieren Sie für 15 Minuten, bevor Sie das absorbierende Set 340 Nanometer aufnehmen.
Dann setzen Sie die Inkubation bei Raumtemperatur für fünf Minuten fort, gefolgt von der Aufzeichnung der Extinktion. Wenn die Absorption gegenüber der nach 15 Minuten aufgezeichneten Absorption zugenommen hat, setzen Sie die Inkubation für fünf Minuten fort, bevor Sie die endgültige Absorption bei 340 Nanometern aufzeichnen. Um die Glykogenverzweigung zu bestimmen, kombinieren Sie 650 Mikroliter Jod-Calciumchlorid-Farbreagenzien mit 100 Mikrolitern Wasser in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen und mischen Sie die Lösung gründlich, bevor Sie sie in eine Einweg-Methacrylatküvette überführen.
Platzieren Sie die Küvette im Spektralphotometer, um einen Lauf in einem Wellenlängen-Scanning-Modus durchzuführen, um das Hintergrundspektrum von 330 bis 800 Nanometern zu erfassen. In einem separaten 1,5-Milliliter-Röhrchen 650 Mikroliter des Arbeitsjod-Calciumchlorid-Farbreagenzes mit 50 Mikrogramm des Austernglykogens verbinden und das Endvolumen mit Wasser auf 750 Mikroliter bilden. Nach gründlichem Mischen der Mischung wird die Lösung in eine Einweg-Methacrylatküvette überführt, um ein Absorptionsspektrum von 330 bis 800 Nanometern zu sammeln.
In ähnlicher Weise erhält man ein Absorptionsspektrum mit 50 Mikrogramm Amylopektin und 30 Mikrogramm Amylose, wie zuvor beschrieben. Um einen Hinweis auf die verzweigte Struktur einer nicht charakterisierten Glykogenprobe zu erhalten, kombinieren Sie 25 bis 50 Mikrogramm des Glykogens mit 650 Mikrolitern des arbeitenden Jod-Calciumchlorid-Farbreagenzes und gehen Sie wie zuvor beschrieben vor, um das Absorptionsspektrum zu erfassen. In den Glykogensynthase-Assays wurde eine lineare Abnahme der Absorption bei 340 Nanometern im Laufe der Zeit beobachtet.
Die Zugabe von zu viel Glykogensynthase zum Assay führte dazu, dass die Reaktion innerhalb der ersten zwei Minuten abgeschlossen war. Die Kontrollreaktion, die keine Glykogensynthase enthielt, zeigte keine messbare Abnahme der Resorption. Die Daten eines Glykogenphosphorylase-Assays mit einem gereinigten Enzym hatten eine lineare Phase, die drei Minuten dauerte.
Eine Absorptionsrate von etwa 0,01 bis 0,04 Einheiten pro Minute ist optimal. Im Glykogen-Debranching-Enzym-Assay zeigte die Reaktion eine lineare Phase, die mindestens 10 Minuten anhielt. Die repräsentativen Daten aus den Glykogenverzweigungsenzym-Assays zeigten den Unterschied in der Absorption zwischen den Kontrollproben, denen das verzweigte Enzym fehlte, und den Reaktionen, die verzweigtes Enzym enthielten.
Der enge dynamische Bereich des Assays wird veranschaulicht. Die maximale Änderung der Extinktion, die erzeugt werden kann, beträgt 0,4 Absorptionseinheiten, und die Linearität geht verloren, wenn die Änderung der Absorption etwa 0,2 Absorptionseinheiten beträgt. Die Massen von Glykogen, Amylopektin und Amylose, die bei der Bewertung der Glykogenverzweigung verwendet wurden, zeigten einen maximalen Extinktionswert von etwa 0,7 bis 0,8, jeweils bei unterschiedlichen Absorptionsmaxima.
Die Glykogenprobe produzierte zwei Peaks bei etwa 400 Nanometern und 460 Nanometern. Das Jod-Calciumchlorid-Farbreagenz ist sehr dicht. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Glykogenproben vollständig mit dem Reagenz vermischt sind, bevor ein Absorptionsspektrum gesammelt wird.
