Unser Protokoll ermöglicht es Forschern, Zytoskelettmotive aus gereinigten Komponenten zu erstellen und die Kräfte, die diese Netzwerke erzeugen, direkt zu messen, um zu verstehen, wie diese mechanischen Komponenten der Zelle sowohl in gesunden als auch in Krankheitszuständen funktionieren. Diese Methode ermöglicht es uns, Kräfte zu quantifizieren und diese Zahlen direkt zu korrelieren, um Parameter der beteiligten Proteine, einschließlich Proteinkonzentration und -dichte, beizubehalten. Parameter, die in der Regel nicht innerhalb der Zelle erfasst werden können.
Diese Methode kann Einblicke in jede Art von Zytoskelett-Netzwerk geben, wie diejenigen, die an der Mitose oder neuronalen Entwicklung beteiligt sind. Es kann leicht angepasst werden, um Netzwerke zu untersuchen, die an der Muskelkontraktion oder Zellmigration beteiligt sind, indem einfach diese spezifischen Proteine ausgetauscht werden. Der kniffligste Aspekt dieser Methode ist die Koordination der verschiedenen Technologien, zu denen eine optische Einzelstrahlfalle und ein TIRF-Mikroskop gehören.
Darüber hinaus erfordern Einzelmolekülexperimente eine sorgfältige Vorbereitung von Oberflächen, wie z. B. dem Deckschlicker, so dass die Vorbereitung qualitativ hochwertiger Proben von größter Bedeutung ist. Beginnen Sie mit dem Bau einer Feuchtigkeitskammer, indem Sie ein zusammengefaltetes, fusselfreies, mit Reinstwasser angefeuchtetes Gewebe auf den Boden einer leeren Pipettenspitzenbox legen. Führen Sie alle Reagenzien ein, indem Sie die Flüssigkeit an einem Ende des Kanals pipettieren und die Flüssigkeit am gegenüberliegenden Ende ableiten.
Mit einer 20-Mikroliter-Pipettenspitze langsam 10 Mikroliter von 0,5 Milligramm pro Milliliter Streptavidin oder NeutrAvidin einfließen. Inkubieren Sie den Objektträger in der Feuchtigkeitskammer für 4 Minuten mit dem Deckel nach unten. Spülen Sie die Kammer mit 20 Mikrolitern eines 1x BRB80 mit einem fusselfreien Gewebe aus, um Flüssigkeiten herauszuziehen.
Nach wiederholtem Ausführen von fließenden Reagenzien und Inkubation erneut mit 10 Mikrolitern 0,5 Milligramm pro Milliliter Kaseinblocklösung spülen. 10 Mikroliter verdünnte biotinyliert-fernrote Mikrotubuli in die Kammer fließen lassen, dann die Kammer mit 20 Mikrolitern 1x BRB80 spülen. Nach dem Fließen des Reagenzes und dem Inkubieren, wie zuvor gezeigt, spülen Sie den Schritt mit 10 Mikrolitern einer geeigneten Konzentration von zu untersuchendem nichtmotorischem Protein, fließen Sie dann in 10 Mikroliter Rhodamin-Mikrotubuli und wiederholen Sie die Inkubation und Spülung.
Als nächstes kombinieren Sie 1 Mikroliter Rigor-Kinesin-beschichtete Perlen und 19 Mikroliter Reaktionspuffer. Verschließen Sie beide Ränder der Kammer mit klarem Nagellack und warten Sie, bis die Politur getrocknet ist. Verwenden Sie ein inverses Mikroskopinstrument, das über eine vollständige interne Reflexionsfluoreszenzbildgebung verfügt und in das eine optische Einzelstrahlfalle eingebaut wurde.
Geben Sie 1 Tropfen Tauchöl auf den Deckkörper der Probenkammer. Legen Sie die abzubildende Probe mit der Deckseite der Probenkammer nach unten auf die Mikroskopplattform. Bringen Sie das Objektiv langsam nach oben, so dass sowohl der Abdeckschein als auch das Objektiv durch das Öl in Kontakt kommen.
Stellen Sie die Objektivhöhe so ein, dass die Deckfläche der Probenkammer scharf ist. Nehmen Sie Einzelbilder der Proben in allen drei Kanälen auf. Verwenden Sie für die Experimente hier 100 bis 200 Millisekunden Belichtung.
Passen Sie die Laserleistung an, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis der Proben zu erzielen und gleichzeitig das Fotobleichen über 2 bis 5 Minuten zu minimieren, wenn das einzelne Bündel analysiert wird. Die Häufigkeit von Mikrotubulibündeln pro Sichtfeld sollte etwa drei bis vier Mikrotubulibündel pro 100 Mikroliter mal 100 Mikroliter Sichtfeld pro Kammer betragen. Beobachten Sie die Dichte der Perlen in der Probe mit einem hellen Feld und dem 100x-Objektiv am Mikroskop.
Verwenden Sie eine Konzentration von Perlen, so dass die Perlen im Durchschnitt mindestens 10 Mikrometer voneinander entfernt sind, und stellen Sie sicher, dass sie frei von jeglicher Art von Oberflächenbegrenzung oder Clusterbildung sind. Stellen Sie sicher, dass die biotinylierten dunkelroten Mikrotubuli fest mit der Oberfläche der Abdeckung verbunden sind und dass das Rhodamin keine sichtbare Brownsche Bewegung aufweist. Stellen Sie sicher, dass die Rhodamin-Mikrotubuli über die Vernetzungskarte an biotinylierten Mikrotubuli befestigt sind und an ihren freien Enden sichtbar schwanken.
Identifizieren Sie ein geeignetes Mikrotubulibündel, das nur zwei Mikrotubuli enthält, einen biotinylierten mit vollflächiger Befestigung und einen nicht-biotinylierten Mikrotubuli, der teilweise frei in Lösung ist und entweder auf der x- oder y-Achse ausgerichtet ist. Verwenden Sie die optische Falle, um eine freie Perle zu erfassen, die die Brownsche Bewegung demonstriert. Sobald die Perle gefangen wurde, bewegen Sie die Perle vorsichtig zum ausgewählten Mikrotubulibündel, um sicherzustellen, dass dabei keine anderen Perlen in die Falle gezogen werden.
Stellen Sie sicher, dass die Perle mehrere Mikrometer von der Überlappungsregion entfernt ist, die vernetzende Proteine enthält. Senken Sie die Wulst in der z-Achse vorsichtig ab, bis sie mit dem Rand des freien Segments des Rhodamin-Mikrotubuli in Kontakt kommt. Ziehen Sie vorsichtig nach oben und bewegen Sie sich senkrecht zur Mikrotubuli-Achse, um die Befestigung zu überprüfen, indem Sie die Biegung des Rhodamin-Mikrotubuli beobachten und der Perlenposition folgen.
Richten Sie den Rhodamin-Mikrotubuli vorsichtig entlang der Mikrotubuli-Achse des oberflächenbefestigten Mikrotubuli aus, indem Sie den Nano-Positionierungstisch bewegen und die Parameter für das automatisierte Ziehen des Mikrotubulibündels einstellen. Stellen Sie die Richtung entlang der parallelen Achse der Mikrotubuli ein. Stellen Sie die gewünschte Zuggeschwindigkeit und die gewünschte Zugzeit in Abhängigkeit von der Überlappungslänge ein.
Beginnen Sie mit der Aufzeichnung von Fluoreszenzdaten in den drei Kanälen mit einer Rate von 1 bis 2 Bildern pro Sekunde. Nutzen Sie die optimierten Laserleistungen und Belichtungszeiten. Initiieren Sie automatisierte Bühnenbewegungen und zeichnen Sie Abfangdaten vom positionsempfindlichen Detektortisch und dem Totalreflexionsfluoreszenz-Kameratisch auf.
Deaktivieren Sie die Fallen, um die Perle freizugeben, und wiederholen Sie das Experiment wie gewünscht. Ensembles des essentiellen mitotischen Motorproteins Kinesin-5 können das Gleiten von Mikrotubuli regulieren, indem sie sowohl Schub- als auch Bremskräfte erzeugen, die linear mit der Überlappungslänge skalieren. Es wurde festgestellt, dass die C-terminale Heckdomäne für eine effiziente Vernetzung und Krafterzeugung erforderlich ist.
Das Protein in voller Länge ist in der Lage, anhaltende Kräfte zu erzeugen, die ein Plateau erreichen, wenn alle Motorproteine ihre individuelle Stillstandskraft erreichen. Der Kinesin-5-Motor, dem jedoch sein C-terminales Heck fehlt, erzeugt maximale Kräfte, die fast fünfmal kleiner sind. Ensembles des nicht-motorischen mitotischen Proteins PRC1 arbeiten als mechanische Dash-Pod, um dem Gleiten von Mikrotubuli in der Anaphasenspindel-Mittelzone zu widerstehen.
Die Widerstandskräfte hängen nicht von der Länge der Überlappungsbereiche zwischen Mikrotubulipaaren oder der lokalen Vernetzerdichte ab, aber sie hängen stark von der Gesamtkonzentration der beteiligten PRC1-Moleküle ab. Diese Methode kann angepasst werden, um verschiedene biologische Systeme wie mikrobielle Organisation und Neuronen unter Verwendung alternativer Proteine zu untersuchen. Es kann auch leicht erweitert werden, um Aktin-basierte Netzwerkgeometrien zu analysieren, um Muskelkontraktion oder Zellmotilität zu untersuchen.
Mit dieser Technik können einzigartige Zellgesamtgeometrien untersucht werden, bei denen Filamente sowohl Spur als auch Fracht sind und durch kleine Proteinensembles organisiert sind. Diese Geometrien ahmen besser nach, was in Zellen während zahlreicher biologischer Prozesse passiert.
