Protokolümüz, araştırmacıların saflaştırılmış bileşenlerden sitoiskelet motifleri oluşturmalarına ve hücrenin bu mekanik bileşenlerinin hem sağlıklı hem de hastalık durumlarında nasıl çalıştığını anlamak için bu ağların ürettiği kuvvetleri doğrudan ölçmelerine olanak tanır. Bu yöntem, protein konsantrasyonu ve yoğunluğu da dahil olmak üzere ilgili proteinlerin parametrelerini korumak için kuvvetleri ölçmemize ve bu sayıları doğrudan ilişkilendirmemize olanak tanır. Hücre içinde elde edilmesi genellikle imkansız olan parametreler.
Bu yöntem, mitoz veya nöral gelişimde yer alanlar gibi her türlü sitoiskelet ağı hakkında bilgi sağlayabilir. Kas kasılması veya hücre göçü ile ilgili ağları incelemek için, kullanılan bu spesifik proteinleri değiştirerek kolayca uyarlanabilir. Bu yöntemin en zor yönü, tek ışınlı optik tuzak ve bir TIRF mikroskobu içeren farklı teknolojilerin koordinasyonudur.
Ek olarak, tek moleküllü deneyler, kapak kayması gibi yüzeylerin dikkatli bir şekilde hazırlanmasını gerektirir, bu nedenle yüksek kaliteli numunelerin hazırlanması çok önemlidir. Boş bir pipet ucu kutusunun altına ultra saf suyla nemlendirilmiş katlanmış, tüy bırakmayan bir doku yerleştirerek bir nem odası inşa ederek başlayın. Sıvıyı kanalın bir ucuna pipetleyerek ve sıvıyı karşı uçtan dışarı atarak tüm reaktifleri tanıtın.
20 mikrolitrelik açılı pipet ucu kullanarak, mililitre streptavidin veya NeutrAvidin başına 10 mikrolitre 0,5 miligram yavaşça akıtın. Nem odasındaki kaydırağı, kapak kayması aşağı bakacak şekilde 4 dakika boyunca inkübe edin. Sıvıları dışarı çekmek için tüy bırakmayan bir doku kullanarak 20 mikrolitre 1x BRB80 kullanarak odayı yıkayın.
Akan reaktifleri ve inkübasyonu bir kez daha tekrarladıktan sonra, mililitre kazein bloke çözeltisi başına 10 mikrolitre 0.5 miligram ile yıkama adımı. 10 mikrolitre seyreltilmiş biyotinile edilmiş uzak kırmızı mikrotübülleri odaya aktarın, ardından odayı 20 mikrolitre 1x BRB80 ile yıkayın. Reaktifi akıttıktan ve daha önce gösterildiği gibi inkübe ettikten sonra, adımı incelenecek uygun bir motor olmayan protein konsantrasyonunun 10 mikrolitresi ile yıkayın, ardından 10 mikrolitre rodamin mikrotübüllerinde akın ve inkübasyonu ve yıkamayı tekrarlayın.
Daha sonra, 1 mikrolitre rigor kinesin kaplı boncuk ve 19 mikrolitre reaksiyon tamponunu birleştirin. Odanın her iki kenarını da şeffaf oje ile kapatın ve cila kuruyana kadar bekleyin. Toplam iç yansıma floresan görüntüleme yeteneklerine sahip olan ve içine tek ışınlı bir optik tuzak inşa edilmiş ters çevrilmiş bir mikroskop cihazı kullanın.
Numune odasının kapak kaymasına 1 damla daldırma yağı ekleyin. Numune odasının kapak kaydırma tarafı aşağı bakacak şekilde, görüntülenecek numuneyi mikroskop platformuna yerleştirin. Hedefi yavaşça yukarı kaldırın, böylece hem kapak kayması hem de amaç arasında yağ yoluyla temas olur.
Objektif yüksekliği, numune odasının kapak kayma yüzeyi odakta olacak şekilde ayarlayın. Her üç kanaldaki örneklerin tek karelik görüntülerini kaydedin. Buradaki deneyler için 100 ila 200 milisaniye pozlama kullanın.
Numunelerden iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için lazer gücünü ayarlayın ve bireysel paket test edildiğinde 2 ila 5 dakika boyunca fotoğraf ağartmasını en aza indirin. Görüş alanı başına mikrotübül demetlerinin frekansı, oda başına 100 mikrolitre görüş alanı ile 100 mikrolitre başına yaklaşık üç ila dört mikrotübül demeti olmalıdır. Numunedeki boncukların yoğunluğunu parlak bir alan ve mikroskoptaki 100x hedefini kullanarak gözlemleyin.
Boncukların birbirlerinden ortalama olarak en az 10 mikrometre uzakta olacak şekilde bir boncuk konsantrasyonu kullanın ve her türlü yüzey hapsinden veya kümelenmesinden arındırılmış olduklarından emin olun. Biyotinile edilmiş uzak kırmızı mikrotübüllerin kapağın yüzeyine sıkıca tutturulduğundan ve rodaminin görünür Brownian hareketi olmadığından emin olun. Rodamin mikrotübüllerinin çapraz bağlama haritası aracılığıyla biyotinile mikrotübüllere bağlandığından ve serbest uçlarında gözle görülür şekilde dalgalandığından emin olun.
Sadece iki mikrotübül içeren, biri tam yüzey bağlantısı ile biyotinile edilmiş ve çözelti içinde kısmen serbest olan ve x veya y ekseninde hizalanmış bir biyotinillenmemiş mikrotübül içeren uygun bir mikrotübül demeti tanımlayın. Brownian hareketini gösteren serbest bir boncuk yakalamak için optik tuzağı kullanın. Boncuk sıkıştıktan sonra, boncuğu dikkatlice seçilen mikrotübül demetine doğru hareket ettirin ve işlem sırasında başka hiçbir boncuğun tuzağa çekilmemesini sağlayın.
Boncukun, çapraz bağlanan proteinler içeren örtüşen bölgeden birkaç mikron uzakta olduğundan emin olun. Boncuğu, rodamin mikrotübülünün serbest segmentinin kenarı ile temas edene kadar z ekseninde dikkatlice indirin. Yavaşça yukarı çekin ve rodamin mikrotübül bükülmesini gözlemleyerek ve boncuk pozisyonunu takip ederek yapışmayı kontrol etmek için mikrotübül eksenine dik olarak hareket edin.
Nano konumlandırma aşamasını hareket ettirerek rodamin mikrotübülünü, yüzeye bağlı mikrotübülün mikrotübül ekseni boyunca dikkatlice yeniden hizalayın ve mikrotübül demetinin otomatik olarak çekilmesi için parametreleri ayarlayın. Mikrotübüllerin paralel ekseni boyunca yönü ayarlayın. Örtüşme uzunluğuna bağlı olarak istenen çekme hızını ve istenen çekme süresini ayarlayın.
Floresan verilerini üç kanala saniyede 1 ila 2 kare hızında kaydetmeye başlayın. Optimize edilmiş lazer güçlerini ve pozlama sürelerini kullanın. Otomatik sahne hareketi başlatın ve konuma duyarlı dedektör aşamasından ve toplam dahili yansıma floresan kamera aşamasından yakalama verilerini kaydedin.
Boncuğu serbest bırakmak için tuzakları devre dışı bırakın ve denemeyi istediğiniz gibi tekrarlayın. Temel mitotik motor proteini kinezin-5'in toplulukları, örtüşme uzunluğu ile doğrusal olarak ölçeklenen hem itme hem de frenleme kuvvetleri üreterek mikrotübül kaymasını düzenleyebilir. C-terminali kuyruk alanının verimli çapraz bağlama ve kuvvet oluşturma için gerekli olduğu bulunmuştur.
Tam uzunluktaki protein, tüm motor proteinler bireysel durma kuvvetlerine ulaştığında plato oluşturan sürekli kuvvetler üretebilir. Bununla birlikte, C-terminal kuyruğundan yoksun olan kinesin-5 motoru, büyüklükte yaklaşık beş kat daha küçük olan maksimum kuvvetler üretir. Motor olmayan mitotik protein PRC1'in toplulukları, anafaz mili orta bölgesinde mikrotübül kaymasına direnmek için mekanik bir çizgi bölmesi olarak çalışır.
Dirençli kuvvetler, mikrotübül çiftleri arasındaki örtüşme bölgelerinin uzunluğuna veya yerel çapraz bağlayıcı yoğunluğuna bağlı değildir, ancak nişanlı PRC1 moleküllerinin toplam konsantrasyonuna büyük ölçüde bağlıdırlar. Bu yöntem, alternatif proteinler kullanılarak mikrobiyal organizasyon ve nöronlar gibi çeşitli biyolojik sistemleri incelemek için uyarlanabilir. Ayrıca, kas kasılmasını veya hücre hareketliliğini incelemek için aktin bazlı ağ geometrilerini analiz etmek için kolayca genişletilebilir.
Bu teknik, filamentlerin hem iz hem de kargo olduğu ve küçük protein toplulukları tarafından organize edildiği benzersiz hücre toplam geometrilerini incelemeye izin verir. Bu geometriler, sayısız biyolojik süreç sırasında hücrelerde neler olup bittiğini daha iyi taklit eder.
