Наш протокол позволяет исследователям строить цитоскелетные мотивы из очищенных компонентов и непосредственно измерять силы, которые генерируют эти сети, чтобы понять, как эти механические компоненты клетки функционируют как в здоровом, так и в болезненном состоянии. Этот метод позволяет нам количественно оценивать силы и напрямую коррелировать эти числа, чтобы сохранить параметры вовлеченных белков, включая концентрацию и плотность белка. Параметры, которые, как правило, невозможно получить внутри ячейки.
Этот метод может дать представление о любом типе сети цитоскелетов, таких как те, которые участвуют в митозе или развитии нейронов. Его можно легко адаптировать для изучения сетей, участвующих в сокращении мышц или миграции клеток, просто заменив эти специфические белки, которые используются. Самым сложным аспектом этого метода является координация различных технологий, которые включают в себя однолучевую оптическую ловушку и микроскоп TIRF.
Кроме того, одномолекулярные эксперименты требуют тщательной подготовки поверхностей, таких как крышка, поэтому подготовка высококачественных образцов имеет первостепенное значение. Начните с создания камеры влажности, поместив сложенную, безворсовую ткань, смоченную сверхчистой водой, на дно пустого ящика для пипетки. Введите все реагенты, пипетируя жидкость на одном конце канала и выводя жидкость на противоположный конец.
Используя 20-микролитровый наконечник пипетки, медленно течь в 10 микролитрах по 0,5 миллиграмма на миллилитр стрептавидина или NeutrAvidin. Высиживайте горку в камере влажности в течение 4 минут, при этом крышка скользит лицом вниз. Смойте камеру, используя 20 микролитров 1x BRB80, используя безворсовую ткань для вытягивания жидкостей.
После повторения проточных реагентов и инкубации еще раз промывку шагом с 10 микролитрами по 0,5 миллиграмма на миллилитр казеина блокирующего раствора. Пропустите 10 микролитров разбавленных биотинилированных-дальне-красных микротрубочек в камеру, затем промывайте камеру 20 микролитрами 1x BRB80. После прокачки реагента и инкубации, как показано ранее, промывайте стадию 10 микролитрами соответствующей концентрации немоторного белка, подлежащего изучению, затем протекайте в 10 микролитрах микротрубочек родамина и повторяйте инкубацию и промывку.
Затем смешайте 1 микролитр бусин с кинезиновым покрытием и 19 микролитров реакционного буфера. Запечатайте оба края камеры прозрачным лаком для ногтей и подождите, пока лак высохнет. Используйте инструмент инвертированного микроскопа, который имеет полные возможности флуоресцентной визуализации внутреннего отражения и в котором была построена оптическая ловушка с одним пучком.
Добавьте 1 каплю погружного масла на крышку пробоотборной камеры. Стороной крышки пробоотборной камеры, обращенной вниз, поместите образец для изображения на платформу микроскопа. Медленно поднимите цель вверх, чтобы был контакт между проскальзыванием крышки и объективом через масло.
Отрегулируйте высоту объектива таким образом, чтобы поверхность крышки пробоотборной камеры находилась в фокусе. Записывайте однокадровые изображения образцов во всех трех каналах. Для экспериментов здесь используйте от 100 до 200 миллисекунд экспозиции.
Отрегулируйте мощность лазера для достижения хорошего соотношения сигнал/шум от образцов, сводя к минимуму отбеливание фотографий в течение 2-5 минут при анализе отдельного пучка. Частота пучков микротрубочек на поле зрения должна составлять приблизительно три-четыре пучка микротрубочек на 100 микролитров на 100 микролитров поля зрения на камеру. Наблюдайте за плотностью шариков в образце, используя яркое поле и 100-кратный объектив на микроскопе.
Используйте концентрацию бусин таким образом, чтобы бусины находились в среднем на расстоянии не менее 10 микрометров друг от друга, и убедитесь, что они свободны от любого вида поверхностного удержания или кластеризации. Убедитесь, что биотинилированные темно-красные микротрубочки прочно прикреплены к поверхности крышки и что родамин не имеет видимого броуновского движения. Убедитесь, что микротрубочки родамина прикреплены к биотинилированным микротрубочкам через карту сшивки и заметно колеблются на своих свободных концах.
Определите подходящий пучок микротрубочек, который содержит только две микротрубочки, одну биотинилированную с полным поверхностным прикреплением и одну небиотинилированную микротрубочку, которая частично свободна в растворе и выровнена по оси x или y. Используйте оптическую ловушку, чтобы захватить свободную бусину, демонстрирующую броуновское движение. После того, как бусина была поймана в ловушку, осторожно переместите бусину в выбранный пучок микротрубочек, гарантируя, что в процессе в ловушку не будут втянуты другие бусины.
Убедитесь, что шарик находится на расстоянии нескольких микрон от области перекрытия, содержащей сшивающие белки. Осторожно опустите шарик по оси Z до тех пор, пока он не соприкоснется с краем свободного сегмента микротрубочки родамина. Осторожно подтяните вверх и двигайтесь перпендикулярно оси микротрубочек, чтобы проверить наличие прикрепления, наблюдая за изгибом микротрубочки родамина и следуя положению шарика.
Тщательно выровняйте микротрубочку родамина вдоль оси микротрубочек поверхностно-прикрепленной микротрубочки, переместив стадию нанопозиционирования и настройте параметры для автоматического вытягивания пучка микротрубочек. Задайте направление вдоль параллельной оси микротрубочек. Установите желаемую скорость вытягивания и желаемое время вытягивания в зависимости от длины перекрытия.
Начните запись флуоресцентных данных в трех каналах со скоростью от 1 до 2 кадров в секунду. Используйте оптимизированные мощности лазера и время экспозиции. Инициируйте автоматическое движение ступени и записывайте данные улавливания с позиционно-чувствительной ступени детектора и ступени камеры полного внутреннего отражения флуоресцентной камеры.
Деактивируйте ловушки, чтобы освободить бусину и повторить эксперимент по желанию. Ансамбли основного митотического моторного белка кинезин-5 могут регулировать скольжение микротрубочек, генерируя как толкающие, так и тормозящие силы, которые линейно масштабируются с длиной перекрытия. Было установлено, что хвостовой домен С-терминала необходим для эффективного сшивания и генерации силы.
Полноразмерный белок способен генерировать устойчивые силы, которые плато, когда все моторные белки достигают своей индивидуальной силы сваливания. Тем не менее, двигатель кинезин-5, не имеющий своего C-концевого хвоста, генерирует максимальные силы, которые почти в пять раз меньше по величине. Ансамбли немоторного митотического белка PRC1 функционируют как механический стручок для сопротивления скольжению микротрубочек в средней зоне анафазного веретена.
Резистивные силы не зависят от длины перекрывающихся областей между парами микротрубочек или локальной плотности сшивки, но они сильно зависят от общей концентрации вовлеченных молекул PRC1. Этот метод может быть адаптирован для изучения различных биологических систем, таких как микробная организация и нейроны, с использованием альтернативных белков. Он также может быть легко расширен для анализа сетевой геометрии на основе актина для изучения сокращения мышц или подвижности клеток.
Этот метод позволяет изучать уникальную общую геометрию клеток, где нити являются как путевыми, так и грузовыми и организованы небольшими ансамблями белков. Эти геометрии лучше имитируют то, что происходит в клетках во время многочисленных биологических процессов.
