私たちのプロトコルにより、研究者は精製された成分から細胞骨格モチーフを構築し、これらのネットワークが生成する力を直接測定して、細胞のこれらの機械的構成要素が健康な状態と病状の両方でどのように機能するかを理解することができます。この方法により、力を定量化し、これらの数値を直接相関させて、タンパク質の濃度や密度など、関与するタンパク質のパラメータを維持することができます。セル内では一般的に取得できないパラメータ。
この方法は、有糸分裂や神経発達に関与するものなど、あらゆるタイプの細胞骨格ネットワークへの洞察を提供することができます。使用されているこの特定のタンパク質を交換するだけで、筋肉の収縮や細胞の移動に関与するネットワークの研究に容易に適合させることができます。この方法の最も難しい側面は、シングルビーム光学トラップとTIRF顕微鏡を含むさまざまなテクノロジーの調整です。
また、1分子実験ではカバースリップなどの表面を慎重に準備する必要があるため、高品質のサンプルを準備することが最も重要です。まず、空のピペットチップボックスの底に超純水で湿らせた折りたたまれた糸くずの出ないティッシュを置き、湿度チャンバーを構築します。チャネルの一方の端で液体をピペッティングし、もう一方の端で液体を吸い上げることにより、すべての試薬を導入します。
20マイクロリットルの角度のピペットチップを使用して、1ミリリットルあたり0.5ミリグラムのストレプトアビジンまたはニュートラアビジンを10マイクロリットルゆっくりと流します。カバースリップを下に向けて、湿度チャンバー内でスライドを4分間インキュベートします。糸くずの出ないティッシュを使用して20マイクロリットルの1x BRB80を使用してチャンバーを洗い流し、液体を引き出します。
試薬の流入とインキュベーションをもう一度繰り返した後、1ミリリットルあたり0.5ミリグラムのカゼインブロッキング溶液で10マイクロリットルをフラッシュします。10マイクロリットルの希釈ビオチン化遠赤色微小管をチャンバーに流し込み、20マイクロリットルの1x BRB80でチャンバーを洗い流します。前に示したように試薬を流してインキュベートした後、研究する10マイクロリットルの適切な濃度の非モータータンパク質でステップを洗い流し、次に10マイクロリットルのローダミン微小管を流し、インキュベーションとフラッシングを繰り返します。
次に、1マイクロリットルのリゴールキネシンコーティングビーズと19マイクロリットルの反応バッファーを混ぜ合わせます。チャンバーの両端を透明なマニキュアで密封し、ポリッシュが乾くまで待ちます。全反射蛍光イメージング機能を有し、シングルビーム光トラップを構築した倒立顕微鏡装置を使用する。
サンプルチャンバーのカバースリップに1滴の浸漬油を追加します。サンプルチャンバーのカバースリップ側を下に向けて、イメージングするサンプルを顕微鏡プラットフォームに置きます。カバースリップと対物レンズの両方がオイルを介して接触するように、対物レンズをゆっくりと持ち上げます。
サンプルチャンバーのカバースリップ面に焦点が合うように対物レンズの高さを調整します。3つのチャンネルすべてでサンプルの単一フレーム画像を記録します。ここでの実験では、100〜200ミリ秒の曝露を使用します。
レーザー出力を調整して、サンプルからの良好な信号対雑音比を達成しながら、個々のバンドルをアッセイするときに2〜5分にわたって光の退色を最小限に抑えます。視野当たりの微小管束の頻度は、100マイクロリットル当たり約3〜4個の微小管束×チャンバー当たり100マイクロリットルの視野であるべきである。明視野と顕微鏡上の100倍の対物レンズを使用して、サンプル中のビーズの密度を観察します。
ビーズが互いに平均10マイクロメートル以上離れるようにビーズの濃度を採用し、表面閉じ込めやクラスタリングがないことを確認してください。ビオチン化遠赤色微小管がカバースリップの表面にしっかりと付着していること、および目に見えるブラウン運動のないローダミンがあることを確認してください。ローダミン微小管が架橋マップを介してビオチン化微小管に付着しており、自由末端で目に見えて変動していることを確認します。
2つの微小管のみを含む適切な微小管束を特定します.1つは全面付着でビオチン化され、もう1つは溶液中に部分的に遊離し、x軸またはy軸のいずれかに整列しているビオチン化されていない微小管です。光学トラップを使用して、ブラウン運動を示すフリービーズをキャプチャします。ビーズがトラップされたら、ビーズを選択した微小管束に慎重に移動し、プロセス中に他のビーズがトラップに引き込まれないようにします。
ビーズが架橋タンパク質を含むオーバーラップ領域から数ミクロン離れていることを確認してください。ローダミン微小管の自由セグメントの端に接触するまで、z軸のビーズを慎重に下げます。ゆっくりと引き上げ、微小管軸に対して垂直に動かし、ローダミン微小管の曲がりを観察し、ビードの位置を追跡して、付着を確認します。
ナノポジショニングステージを動かして、表面付着微小管の微小管軸に沿ってローダミン微小管を慎重に再調整し、微小管束の自動引っ張りのパラメータを設定します。微小管の平行軸に沿った方向を設定します。オーバーラップの長さに応じて、希望のプル速度と希望のプル時間を設定します。
3つのチャンネルで1〜2フレーム/秒の速度で蛍光データの記録を開始します。最適化されたレーザー出力と露光時間を使用します。自動ステージモーションを開始し、位置感応検出器ステージと全反射蛍光カメラステージからのトラップデータを記録します。
トラップを無効にしてビーズを解放し、必要に応じて実験を繰り返します。必須の有糸分裂モータータンパク質kinesin-5のアンサンブルは、オーバーラップ長に比例してスケーリングする押し力とブレーキ力の両方を生成することにより、微小管の滑りを調節できます。C末端テールドメインは、効率的な架橋と力の発生に必要であることがわかりました。
全長タンパク質は、すべてのモータータンパク質が個々の失速力に達すると、停滞する持続的な力を生成することができます。しかし、C末端テールを持たないキネシン5モーターは、大きさがほぼ5倍小さい最大力を生成します。非運動性有糸分裂タンパク質PRC1のアンサンブルは、後期紡錘体中央ゾーンでの微小管の滑りに抵抗する機械的なダッシュポッドとして機能します。
抵抗力は、微小管対間のオーバーラップ領域の長さや局所的な架橋剤密度には依存しませんが、関与したPRC1分子の総濃度に強く依存します。この方法は、代替タンパク質を使用することにより、微生物組織やニューロンなどの多様な生物学的システムの研究に適応できます。また、アクチンベースのネットワーク形状を分析して、筋肉の収縮や細胞の運動性を研究するために容易に拡張することもできます。
この技術により、フィラメントがトラックとカーゴの両方であり、タンパク質の小さなアンサンブルによって編成されているユニークな細胞総形状を研究することができます。これらの形状は、多数の生物学的プロセス中に細胞内で起こっていることをよりよく模倣します。
