Das Protokoll bietet eine einfache Methode zur Reinigung aktiver molekularer Motoren mit dem Sf9-Baculovirus-System. Es beschreibt auch Einzelmolekülmotilität und multimotorische Gleitassays, um den Regulationsmechanismus von Motorproteinen zu untersuchen. All diese traditionelle Vektorexpression Sf9-Baculovirus-Expression und einstufige Affinitätsreinigung wird dazu führen, dass reines und aktives Motorprotein die mechanistischen Details von superprozessiven Kinesinen in Einzelmolekül- und Multimotorsystemen untersucht.
Zusätzlich zu Kinesin-Motoren kann das Protokoll angewendet werden, um biochemische und biophysikalische Eigenschaften anderer zytoskelettbasierter Proteine wie Dionin und Myosin zu untersuchen. Das Protokoll ist detailliert und leicht zu befolgen. Einige Vorschläge sind, Sf9-Zellen vorsichtig zu behandeln, da sie anfällig für Kontamination sind, und die Hinweise im Protokoll zu befolgen.
Die visuelle Demonstration ist sehr effektiv, leicht zu befolgen und die kritischen Schritte zu verstehen, insbesondere für diejenigen, die diese Assays noch nie durchgeführt haben. Pushpanjali Soppina und Dipeshwari Shewale, Doktoranden, die mit mir und Pradeep Naik zusammenarbeiten, demonstrieren das Verfahren. Um zu beginnen, säen Sie die Zellen in einer 35-Milliliter-Schale, bei einer Dichte von 4,5 mal 10 bis zur fünften Zellen pro Milliliter.
Mischen Sie nach 24 Stunden ein Mikrogramm Bacmid-DNA und 100 Mikroliter unergänzte Grace-Medien in einer Röhre. Mischen Sie sechs Mikroliter Transfektionsreagenz in einem anderen Röhrchen mit 100 Mikrolitern unergänztem Grace-Medium. Übertragen Sie den Inhalt des ersten Röhrchens vorsichtig in das zweite Röhrchen.
Mischen Sie sie und inkubieren Sie die Mischung für 45 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie 0,8 Milliliter unergänztes Grace-Medium zu der Mischung hinzu. Mischen und saugen Sie die Sf900 SFM-Medien aus den Zellen ab.
Fügen Sie das vorbereitete Transfektionsmedium tropfenweise auf die Oberseite der Zellen und inkubieren Sie die Platte für sechs Stunden. Entfernen Sie dann vorsichtig die Transfektionsmischung. Fügen Sie zwei Milliliter SF900 SFM-Medien hinzu und inkubieren Sie 48 Stunden lang bei 28 Grad Celsius weiter.
Als nächstes überprüfen Sie die Motorproteinexpression unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop. Ernten Sie das Medium mit infizierten Zellen und drehen Sie es fünf Minuten lang bei 500 G.Sammeln Sie den Überstand und frieren Sie die Aliquots ein. Fügen Sie 10 Milliliter SF900 SFM-Medien mit Zellen und einen Milliliter P-Zero-Virusmaterial in einem sterilen, 100-Milliliter-konischen Kolben hinzu.
Bei 28 Grad Celsius mit ständigem Schütteln bei 90 U/min inkubieren. Nach 72 Stunden drehen Sie die Zellen in einem 15 Milliliter, sterilen konischen Röhrchen bei 500 G für fünf Minuten herunter und sammeln den Überstand. Für die großflächige Proteinexpression infizieren Sie 30 Milliliter der Suspensionskultur mit einem Milliliter P1-Stammvirus.
Überprüfen Sie 72 Stunden nach der Infektion die Zellen auf Proteinexpression und sammeln Sie die Zellen in sterilen, 50 Milliliter, konischen Röhrchen. Nach dem Spinnen den Überstand verwerfen und das Zellpellet sammeln. Um die Zellen zu lysieren, fügen Sie dem Zellpellet drei Milliliter eiskalten Lysepuffer hinzu.
Drehen Sie das Zelllysat bei 150.000 G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand und mischen Sie ihn mit 40 Mikrolitern 50% ANTI-FLAG M2 Affinitätsharz. Inkubieren Sie die Mischung bei vier Grad Celsius für drei Stunden mit Ende-zu-Ende-Taumeln.
Pelletieren Sie nun das FLAG-Harz, indem Sie es bei 500 G für eine Minute bei vier Grad Celsius drehen. Waschen Sie das FLAG-Harzpellet dreimal mit eiskaltem Waschpuffer. Und nach der dritten Wäsche den Waschpuffer vorsichtig abtropfen lassen.
Als nächstes fügen Sie dem Harzpellet 70 Mikroliter Waschpuffer mit 100 Mikrogramm pro Milliliter FLAG-Peptid hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius, wie zuvor gezeigt. Nach dem Schleudern den Überstand mit gereinigtem Protein in einem frischen Röhrchen sammeln. Bereiten Sie eine Polymerisationsmischung wie im Manuskript beschrieben vor und fügen Sie der Polymerisationsmischung 10 Mikroliter Tubulin hinzu.
Das Röhrchen in einen bei 37 Grad Celsius vorgewärmten Wärmeblock geben und 30 Minuten inkubieren. Nachdem Sie den Mikrotubuli-Stabilisierungspuffer vorbereitet haben, erwärmen Sie ihn und fügen Sie ihn zu den polymerisierten Mikrotubuli hinzu. Sobald die Motilitätsflusszellenkammer vorbereitet ist, fließen 30 Mikroliter verdünnte Mikrotubulilösung durch die Kammer.
Nach 30 Minuten 40 bis 50 Mikroliter blockierenden Puffer fließen lassen und inkubieren. Bereiten Sie eine Motilitätsmischung vor und fügen Sie einen Mikroliter des gereinigten Motors hinzu. Gut mischen und die Lösung in die Motilitätskammer fließen lassen.
Versiegeln Sie beide Enden der Motilitätskammer und des Bildes unter TIRF-Beleuchtung. Konzentrieren Sie sich auf die einzelnen mCitirine-markierten Motoren, die sich prozessiv bewegen. Mischen Sie Rhodamin-markiertes Tubulin mit unmarkiertem Tubulin in einem Verhältnis von eins zu 10.
Nach 30 Minuten Polymerisation fügen Sie vorsichtig 30 Mikroliter vorgewärmten Mikrotubuli-Stabilisierungspuffer hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius weiter. Scheren Sie die Mikrotubuli durch Pipettieren mit der Kapillarbelastungsspitze. Nach der Vorbereitung der Motilitätsflusskammer 50 Mikroliter Sf9-gereinigte GFP-Nanobodies fließen und 30 Minuten inkubieren.
Blockieren Sie die Deckschlupffläche, indem Sie 50 Mikroliter Blockpuffer fließen lassen. Bereiten Sie 50 Mikroliter der Motormischung vor. Nach vorsichtigem Mischen der Lösung in die Kammer fließen lassen und 30 Minuten inkubieren.
Waschen Sie die Kammer zweimal mit 50 Mikrolitern P12-Kasein. Bereiten Sie die gleitende Assay-Mischung vor und mischen Sie sie vorsichtig, bevor Sie sie in die Motilitätskammer fließen lassen. Versiegeln Sie die Enden der Motilitätskammer und stellen Sie sich das Gleiten von Mikrotubuli unter TIRF-Beleuchtung vor.
Nach 48 Stunden Transfektion erscheinen die nicht transfizierten Zellen klein, rund und fest anhaftet. Die transfizierten Zellen, die Protein exprimieren, waren jedoch lose an der Oberfläche befestigt und zeigten einen vergrößerten Zelldurchmesser. Nach 72 Stunden exprimierten mehr als 90% der Sf9-Zellen fluoreszenzmarkierte Kinesin-3-Motor-KIF1A, und die Zellen waren lose an die Oberfläche gebunden.
Das Kinesin-3-Motorprotein wurde aus den transfizierten Sf9-Zellen gereinigt. Der Kymograph zeigt den Kinesin-3-Motor, der prozessiv entlang der Mikrotubulioberfläche geht. Motilitätsereignisse zeigten eine durchschnittliche Geschwindigkeit und Lauflänge von etwa 2,44 Mikrometern pro Sekunde bzw. 10,79 Mikrometern.
Der Kymograph zeigt ein glattes Mikrotubuli-Gleiten der Kinesin-3-Motoren mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von etwa 1,37 Mikrometern pro Sekunde an. Das Wichtigste ist, den Stabilisierungspuffer hinzuzufügen, ohne die Mikrotubulimischung zu stören und den Mikrotubuli nicht zu scheren. Das Protokoll wäre nützlich für andere Anwendungen, wie ATPase-Messungen, biophysikalische Analysen, Mechanismen, In-vitro-Rekonstitutionsassays usw.
Mit sf9-gereinigten Motoren haben wir kürzlich gezeigt, dass Kinesin-3-Motoren schnell und superprozessiv sind. Interessanterweise weisen diese Motoren im Vergleich zum gut charakterisierten Motor Kinesin-1 hohe ATP-Umschlagsraten auf.
