Das Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 ist ein bidirektionales Motorprotein. Cin8 bewegt sich in der Minus-End-Richtung der Mikrotubuli als einzelnes Molekül und ändert die Direktionalität unter einer Reihe verschiedener experimenteller Bedingungen. Das übergeordnete Ziel unserer Forschung ist es, den Mechanismus der bidirektionalen Motilität zu verstehen, indem Faktoren und Strukturelemente untersucht werden, die die bidirektionale Motilität von Cin8 regulieren.
Dieses Protokoll erklärt umfassend die Reinigung von GFP-Typ-Cin8 in voller Länge, die in Hefezellen überexprimiert wird, den Einzelmolekül-Motilitätsassay und die anschließende Analyse der beweglichen Eigenschaften einzelner Moleküle und Cluster von Cin8. Diese Trennung ist wichtig, da die Direktionalität von Cin8 durch seine Akkumulation in Clustern auf dem Mikrotubuli beeinflusst wird. Diese Technik kann leicht angepasst werden, um andere Kernproteine aus der Hefe zu reinigen.
Darüber hinaus kann es auf alle fluoreszierenden Partikel angewendet werden, die basierend auf ihrer Fluoreszenzintensität in Größengruppen unterteilt werden müssen. Das Verfahren wird von Dr. Mary Popov, unserer Laborleiterin, Dr. Alina Goldstein-Levitin und Dr. Nurit Siegler, Postdoktoranden, demonstriert; Tatiana Zvagelsky, Mayan Sadan, und Shira Hershfinkel, Doktoranden; und Neta Yanir, Yahel Abraham, Roy Avraham und Meital Haberman, Studenten aus unserem Labor. Züchten Sie zunächst Saccharomyces cerevisiae-Zellen, die das Plasmid zur Überexpression von Cin8-GFP-6His enthalten, bis zur exponentiellen Wachstumsphase in einem Liter hefeselektivem Medium, ergänzt mit 2% Raffinose bei 28 Grad Celsius.
Induzieren Sie dann Cin8-GFP-6Seine Überexpression durch Zugabe von 2% Galaktose und überwachen Sie das Wachstum der Hefekultur, indem Sie die Absorption bei 600 Nanometern messen. Fünf Stunden nach der Galaktosezugabe die Zellen durch Zentrifugation ernten. Suspendieren Sie die Zellen im Lysepuffer und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein.
Als nächstes mahlen Sie die gefrorenen Zellen mit einem gekühlten Mörser und einem Stößel in flüssigem Stickstoff. Fügen Sie während des Mahlens flüssigen Stickstoff hinzu, damit die Extrakte gefroren bleiben. Überwachen Sie die Zelllyse unter einem Phasen- oder Differentialinterferenzkontrastmikroskop.
Dann tauen Sie die gemahlenen Zellen auf und zentrifugieren Sie sie. Laden Sie den Überstand auf eine Schwerkraftsäule, die mit zwei Millilitern Nickel-NTA gefüllt ist, und gleichen Sie ihn mit Lysepuffer aus. Lassen Sie den Überstand durch die Säule fließen.
Waschen Sie die Säule mit fünf Säulenvolumina Lysepuffer, gefolgt von fünf Säulenvolumina Lysepuffer, ergänzt durch 25-millimoläres Imidazol. Dann den Cin8-GFP-6His mit Elutionspuffer eluieren. Analysieren Sie die eluierten Proben durch SDS-PAGE-Fraktionierung, gefolgt von Coomassie-Blaufärbung und Western-Blot-Analyse, die mit Anti-GFP-Antikörpern untersucht wurde.
Nachdem Sie die Fraktionen, die Cin8-GFP-6His enthalten, gepoolt haben, reinigen Sie sie durch Größenausschlusschromatographie bei einer Durchflussrate von 0,5 Millilitern pro Minute und einer Säulendruckgrenze von 1,5 Megapascal. Überwachen Sie gleichzeitig die Absorption bei 280 Nanometern. Sammeln Sie die Fraktionen, die dem Cin8-GFP-Tetramer entsprechen, und analysieren Sie sie mittels SDS-PAGE und Western Blotting.
Dann aliquot die ausgewählten Fraktionen, Snap-Freeze und bis zum Gebrauch bei minus 80 Grad Celsius lagern. Um die mit Biotin und Rhodamin markierten Mikrotubuli zu polymerisieren und zu stabilisieren, mischen Sie die Reaktionskomponenten in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Dann fügen Sie 80 Mikroliter warmen allgemeinen Tubulinpuffer hinzu, mischen Sie vorsichtig und zentrifugieren Sie.
Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet vorsichtig, indem Sie mit 50 Mikrolitern warmem allgemeinen Tubulinpuffer auf und ab pipettieren. Dann lagern Sie die Aufhängung bei 28 oder 37 Grad Celsius. Untersuchen Sie die Mikrotubuli mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des 647-Nanometer-Rhodaminkanals.
Entfernen Sie als Nächstes das Schutzpapier von den Bandstreifen und legen Sie ein silanisiertes Deckglas auf die Streifen, um drei 10-Mikroliter-Volumenstromkammern zu schaffen. Führen Sie dann die Avidin-Beschichtung des Deckglases durch sequentielle Zugabe der angegebenen Reagenzien durch. Inkubieren Sie das Deckglas für drei bis fünf Minuten, bevor Sie es mit 80 Mikrolitern allgemeinem Tubulinpuffer waschen.
Als nächstes befestigen Sie die biotinylierten Mikrotubuli an den b-BSA / avidinbeschichteten Deckgläsern, indem Sie 20 Mikroliter Mikrotubuli in die Durchflusskammer einführen. Inkubieren Sie die Dias mit dem Deckglas nach unten in einer dunklen Feuchtigkeitskammer für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Objektträger mit 200 Mikrolitern allgemeinem Tubulinpuffer.
Als nächstes tragen Sie 30 Mikroliter Motilitätsreaktionsmischung auf, gefolgt von Cin8-GFP-Motoren, die in 20 Mikrolitern der Motilitätsreaktionsmischung verdünnt sind, in die Durchflusskammer und fahren Sie sofort fort, die Bewegung der Motoren entlang der Mikrotubuli abzubilden. Für die Bildgebung der motorischen Motilität legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Mikroskopobjektiv und platzieren Sie dann die Durchflusskammer auf der fluoreszierenden Mikroskopstufe, wobei das Deckglas dem Objektiv zugewandt ist. Schalten Sie den Rhodaminkanal ein, um sich auf die Mikrotubuli zu konzentrieren, die an der Deckglasoberfläche befestigt sind.
Erfassen Sie dann mit der ImageJ Micro-Manager-Software das Bild mit einer Belichtung von 20 Millisekunden. Schalten Sie als Nächstes den GFP-Kanal ein und erfassen Sie 90 Zeitrafferbilder mit einem Ein-Sekunden-Intervall und einer Belichtung von 800 Millisekunden. Öffnen Sie in der ImageJ Fiji-Software den Zeitrafferfilm und das entsprechende Mikrotubuli-Feldbild.
Synchronisieren Sie diese beiden Fenster, indem Sie Analysieren und anschließend Extras und Fenster synchronisieren auswählen. Um einen Kymographen zu erhalten, markieren Sie einen Mikrotubuli mit der Option Segmentierte Linie. Wählen Sie dann unter Analysieren die Registerkarte Multi Kymograph aus.
Um die Clustergröße der Cin8-GFP-Moleküle zu bestimmen, führen Sie die Hintergrundsubtraktion und Korrektur für ungleichmäßige Beleuchtung durch, indem Sie auf Verarbeiten klicken, gefolgt von Hintergrund subtrahieren. Stellen Sie den Radius der rollenden Kugel auf 100 Pixel ein und aktivieren Sie die Option Schiebeparaboloid. Verfolgen Sie dann einen bestimmten, nicht beweglichen Cin8-GFP-Motor mit dem TrackMate-Plugin der ImageJ Fiji-Software.
Wählen Sie Plugins, gefolgt von Tracking, TrackMate, LoG-Detektor und Simple LAP-Tracker, um die mittlere Fluoreszenzintensität des Cin8-GFP-Motors als Funktion der Zeit innerhalb eines Kreises von vier Pixeln Radius zu verfolgen. Nachdem Sie das Verfahren für verschiedene Cin8-GFP-Motoren wiederholt haben, zeichnen Sie die Fluoreszenzintensitäten als Funktion der Zeit auf. Um die Motilität der Cin8-GFP-Moleküle entlang der Mikrotubuli-Spuren zu verfolgen, schneiden Sie die Mikrotubuli zu, die in der Zeitraffersequenz der aufgezeichneten Frames analysiert werden sollen, indem Sie sie mit dem Rechteckwerkzeug markieren und auf Bild klicken, gefolgt von Zuschneiden.
Wählen Sie für die Analyse ein fluoreszierendes Cin8-GFP-Partikel. Zeichnen Sie die Partikelkoordinaten in jedem Frame der Zeitraffersequenz mit dem Punktwerkzeug und den Optionen "Messen" auf. In ähnlicher Weise zeichnen Sie Koordinaten für andere fluoreszierende Partikel in der Zeitraffersequenz auf.
Weisen Sie dann allen untersuchten Cin8-GFP-Partikeln im ersten Rahmen ihres Auftretens die Clustergröße zu, wie bereits gezeigt. Als nächstes berechnen Sie unter Verwendung der angegebenen Formel und der ermittelten Cin8-GFP-Bewegungskoordinaten die Verschiebungen von Cin8-GFP zu jedem Zeitpunkt in Bezug auf die Anfangskoordinaten. Berechnen Sie aus diesen Verschiebungswerten die Verschiebung für alle möglichen Zeitintervalle für ein spezifiziertes Cin8-GFP-Partikel.
Wiederholen Sie den Vorgang für alle untersuchten Cin8-GFP-Partikel. Zeichnen Sie schließlich die mittlere Verschiebung aller untersuchten Cin8-GFP-Partikel im Vergleich zum Zeitintervall auf und unterziehen Sie sie einer linearen Anpassung. Die Steigung dieser Anpassung stellt die mittlere Geschwindigkeit von beweglichen Cin8-GFP-Partikeln dar.
Die Motilitätseigenschaften des bidirektionalen Motorproteins Cin8 unterschiedlicher Clustergrößen auf einzelnen Mikrotubuli sind hier dargestellt. Für jede Clustergrößenkategorie wurden mehr als 40 Trajektorien einzelner Cin8-GFP aus den Aufnahmen extrahiert. Die Darstellung der mittleren Verschiebungen einzelner Moleküle und Cluster von Cin8-Motoren als Funktion des Zeitintervalls zeigte, dass sich einzelne Cin8-GFP-Moleküle in einer unidirektionalen Minus-End-gerichteten Weise mit hoher Geschwindigkeit bewegen.
Im Gegensatz dazu weisen Cin8-Cluster eine geringere Geschwindigkeit und eine höhere bidirektionale Motilität auf. Während der Durchführung dieses Verfahrens muss hochreines Motorprotein verwendet werden, um Kontaminationen zu vermeiden, die das motorische Clustering beeinträchtigen können. Bei der Analyse der motorischen Fluoreszenzintensität ist es wichtig, die Motoren im ersten Bild, in dem sie erscheinen, zu untersuchen, um den Effekt der Photobleiche zu vermeiden.
Bei der Untersuchung der Motilität bidirektionaler Motoren ist es äußerst wichtig, einzelne Moleküle und Cluster getrennt zu analysieren, da das motorische Clustering einer der Schlüsselfaktoren ist, die die motorische Richtungalität beeinflussen.
