Besonderen Dank an Kris Ngai und Jason Del Rio für ihre Unterstützung und Hilfe in diesem Projekt. Diese Arbeit wurde von RO1 Zuschuss zu GM070676 SPG unterstützt.

Stämme von Fliegen können gekauft werden und verstärkt im Labor. Je nach der Menge von Drosophila Kultur Fläschchen erhalten, braucht man zu häufig &quot;umkippen&quot; die Kultur Fläschchen, Ampullen, sobald die maximale Kapazität erreicht hat. Die Verstärkung wird fortgesetzt, bis etwa 50 Drosophila Kultur Fläschchen gefüllt sind. Man macht dann &quot;fliegen cups &#39;mit 100 ml Becher Dreispitz (Fly Cup Herstellung wird im nächsten Abschnitt). Nach 24 Stunden verwenden Embryonen aus diesen Bechern zu Saatgut neue Drosophila Kultur Fläschchen mit aufgeklebten Fliege Nahrung am Boden. Bei Raumtemperatur sind die Wachstumszeit für Drosophila-Embryonen aus Embryonen über Nacht zu ausgewachsenen Fliegen etwa 8,5 Tage. Seeded Embryonen schlüpfen nach 12-15 Stunden in die erste Larvenstadium. Die Larven für etwa 4 Tage Häutung zweimal in der zweiten und dritten Larvenstadium, 24 und 48 Stunden nach dem Schlüpfen wachsen. Die Larven dann in pupariums kapseln und als Beitrag für einen 4 Tage bis zur Metamorphose, die aus tErben Puppenstadium Fällen ein. Lassen Sie für mehr Wachstum für etwa zwei bis drei Tage in den Drosophila Kultur Fläschchen, um die Menge von Fliegen in jeder zu erhöhen. Wenn 400 Ampullen gefüllt sind, wird es eine ausreichende Menge von Fliegen für 50 Tassen Eiablage (etwa 1.000 weibliche Fliegen pro Tasse). Fliegen brauchen Zeit, um an ihre neue Umgebung anpassen. Normalerweise dauert es etwa zwei Tage für sie zur Abholung bereit, nachdem sie an den Cups übertragen. Ersetzen Agarplatten täglich halten die Fliege Tassen sauber, die es erlauben, Fliegen, länger zu leben. (Zum weiteren Verständnis von Drosophila Pflege und Verstärkung, siehe DB Roberts &#39;Drosophila: A Practical Approach 2). Eine gute Quelle für große Mengen von Drosophila-Embryonen erhalten sind Bevölkerung Käfigen 3, die kommerziell erhältlich sind. Die Montage und Wartung der Bevölkerung Käfige können auf Kapitel 5 und 7 in dem Buch Drosophila Melanogaster gesehen werden: PRAKTISCHE Verwendungen in Zell-und Molekularbiologie 4. Allerdings sind Bevölkerung Käfige sind teuer und schwer zu pflegen. Da Bevölkerung Käfigen eine reichliche Menge von Fliegen halten kann, ist die Verwendung von Kohlendioxid, die für Überführungs und Zuführvorrichtung Fliegen. Wie bereits erwähnt, nimmt Kohlendioxid, die Gesundheit der Fliegen, wodurch sie nicht so gut lag. Im kleinen Maßstab kann 100 ml Dreispitz Becher verwendet werden. Mit 50 100 ml Becher, kann 9 Gramm dechorionated Embryonen erreicht werden. Damit entfernen Sie die toten Fliegen, ungebraucht Hefepaste und andere Verunreinigungen wir eine doppellagige Sieb Catcher mit verschiedenen Maschenweiten geschaffen haben. Ein Sieb fängt unerwünschte Stoffe wie tote Fliegen und ermöglicht Embryonen passieren (350 Mikron Porengröße). Der zweite Teil enthält ein Mesh (120 Mikron Porengröße), was bedeutete, zu Drosophila-Embryonen und andere Verunreinigungen fangen wird durch die Maschen passieren wird. 1. Fly Cup Vorbereitung und Embryo-Entnahme <ol><li> Flipdie verstärkten fliegt von mehreren Fläschchen in ein leeres Fläschchen aus Kunststoff, bis der Betrag von Fliegen haben ein Zoll von dem Fläschchen in der Höhe erreicht. Dann übertragen Sie diese Fliegen in einem 100 ml Becher Eiersammlung (Tricon-Becher mit Nylon-Mesh-Fenster). Klopfen Sie den Becher auf eine harte Oberfläche, an der Flucht zu verhindern, wenn die Übertragung Fliegen Fliegen. Becher mit Deckel Agarplatte Hefepaste und erlauben 24-48 Stunden Zeit für eine Stabilisierung. </li><li> Sammeln Sie über Nacht Agarplatten von 50 fly Tassen und waschen Sie den Inhalt der Platten auf dem Sieb catcher mit einem sauberen Pinsel und fließendes Wasser. Flesh die Embryonen im Sieb mit Wasser abspülen, bis das gesamte Hefe Paste wird weggespült. </li><li> Dechorionate die gereinigten Embryonen, die durch Eintauchen in 50% Bleichmittel für 3 min. </li><li> Spülen Sie mit destilliertem Wasser ausgiebig bis Embryonen locker das Bleichmittel Geruch. Dann trocknen die Masche mit Embryonen, indem sie auf AC fach Handtuch mehrfach. Übertragen Sie die Embryonen auf eine saubere Flasche und das Gewicht aufgezeichnet. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. Embryo Homogenisierung und Klärung <ol><li> Platzieren Sie dechorionated Embryonen in Dounce Homogenisator mit 1,5 x Volumen eiskaltem Extraktionspuffer. </li><li> Haben fünf Schläge mit dem losen Pistill. Aliquotieren das Homogenat in sauberes Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren bei 15.000 g für 40 min. bei 4 ° C </li><li> Sorgfältig sammeln klare Flüssigkeit ohne den oberen weißen Lipidschicht oder der unteren Pellet. </li><li> Überstand in Zentrifugenröhrchen reinigen und zentrifugieren bei 50.000 g für 30 min. bei 4 ° C </li><li> Resultierender High-Speed-Überstand gesammelt, wie oben erläutert kann sofort verwendet werden oder kann schockgefroren und bei -80 ° C für Monate. </li></ol> 3. Mikrotubulus-Polymerisation und Kinesin Binding <ol><li> Auftauen gefrorenen Breitband-Überstand auf Raumtemperatur. An Mikrotubuli polymerisieren, fügen GTP (0,3 mM) und Taxol (20 uM) und vorsichtig schütteln, bei Raumtemperatur für 20 min ineinem rotierenden Schüttler. </li><li> Um Kinesin binden, fügen 2,5 mM nicht hydrolysierbaren ATP-Analogon 5&#39;-Adenylat Imidodiphosphat (AMPPNP), durch eine 10 min Rühren bei Raumtemperatur in einem rotierenden Schüttler folgt. </li></ol> 4. Differenzielle Sedimentation von Mikrotubuli und Kinesin <ol><li> Sediment durch ein gleiches Volumen Saccharose-Kissen (20% Saccharose und 10 uM Taxol in Extraktionspuffer) durch Zentrifugation bei 23.000 g (sw41ti Rotor TLS-55) für 30 min. bei 4 ° C </li><li> Waschen Pellet durch Resuspension in 10% der ursprünglichen Homogenats Volumen in Extraktionspuffer, enthaltend 10 uM Taxol und 75 mM NaCl. </li><li> Wiederholen Sie die Sedimentation mit einem anderen gleichen Volumen Saccharose-Kissen wie in Schritt 4.1. </li><li> Resuspendieren Pellet aus Salt Wash in 5% Extraktionspuffer mit 20 uM Taxol, 75 mM NaCl, 10 mM MgSO 4 und 10 mM ATP. </li><li> Sediment bei 120.000 g (sw41ti Rotor: 31.000 rpm, TLS-55: 42.000 rpm) für 20 Minuten bei 4 ° C Sammle Überstand (KinesinFraktion). </li><li> Führen Sie eine zentrifugale Filtration bei 14.000 g für 15 min bei 4 ° C Wiederherstellen konzentrierten Probe und wiederholen Filtration durch einen neuen Filter, wie oben für 30 Minuten und der konzentrierten Probe zu sammeln. </li><li> Führen Sie eine Protein-Assay, um die Konzentration zu bestimmen. Kurz gesagt, verschiedener Konzentrationen eines bekannten Protein; wurde (Rinderserumalbumin BSA) mit einem bekannten Volumen von Bradford-Reagenz gemischt und maß die optische Dichte bei 595 nm Wellenlänge. Dann eine optische Dichte gegen die Konzentration Standardkurve wurde gegründet, um die unbekannte Konzentration von gereinigtem Kinesin-Fraktion mit der optischen Dichte dieser Probe unter ähnlichen Bedingungen wie die der Standard-BSA-Proben gemessen berechnen. Gel-Elektrophorese sowie Western-Blot wurde auch unter Verwendung einer bekannten Menge des gereinigten Kinesin. </li><li> Aliquot Kinesin-Fraktion in kleinen Mengen der gewünschten Konzentration und Schnellfrostmedium in flüssigem Stickstoff bei -80 ° C lagern </li></ol> In voller Länge wurde aus funktionellen Kinesin Drosophila-Embryonen gereinigt. 1 zeigt die mit Silber gefärbten Gel, welche die verschiedenen Fraktionen während der Reinigung. Spur 1 ist ein Beispiel für die Hochgeschwindigkeits-Überstand nach Klärung (Schritt 2.5), Spur 2 eine Probe des Pellets nach Klärung, ist Bahn 3 eine Probe des Überstandes nach der ersten Sedimentation mit Saccharose-Kissen (Schritt 4.1), Spur 4 wird eine Probe von dem Pellet nach der ersten Sedimentation, Bahn 5 ist eine Probe des Überstandes nach der zweiten Sedimentation (Schritt 4.3), Spur 6 eine Probe des Pellets nach dem zweiten Sedimentation, Spur 7 ist eine Probe des Pellets von Die Nachklärbecken (Schritt 4.5), Spur 8 ist das gereinigte Kinesin Beispiel ist die Spur 9 filtriert Kinesin Probe und Spur 10 ist der Marker. Die konzentrierte Bande in Spur 8 und 9 auf rund 115 kD ist Kinesin Heavy Chain 1, die im Einklang mit Figur iste 1, Spur 8 des Saxton Papier 1988 5 veröffentlicht. 2 stellt die Western-Blot-c des gereinigten Kinesin-Fraktion unter Verwendung der schweren Kette Kinesin-Antikörper ist. Der Antikörper AKINO1-A nicht signifikant mit anderen Familienmitgliedern Kinesin 6 kreuzreagieren. Beachten Sie, dass, obwohl dieses Protokoll zu einer guten Quelle funktioneller Kinesin, während die Fraktion für Kinesin-1 angereichert ist, gibt es wahrscheinlich Verunreinigungen, einschließlich möglicherweise andere Kinesine und anderen motorischen Proteine. Wir entfernten eine Vielzahl von kleineren Verunreinigungen durch Filtration. Soweit das Entfernen anderer Motoren, die nicht die Größe allein gemacht werden kann, ist die Reinigung ähnlich dem, was von anderen getan werden, um Kinesin 7 studierst, und wir glauben, dass die Mehrheit der aktiven Motor Kinesin-1 ist, anspruchsvollere Reinigung ermöglichen würde Beseitigung potenzieller Motor Verunreinigungen, wie wurde von Cole et al 8 und Saxton et al. 9 </p&gt; Die Prozessivität der Kinesin wurde durch in vitro einzelnes Molekül Mikrotubuli Bindungstest, wie detaillierter in dem Buch von Scholey dem Titel &quot;Motilität Assay für Motorproteine&quot; 10 beschrieben ausgewertet. Kurz gesagt, wurden Polystyrol-Kügelchen mit einem einzigen aktiven Motors in Kontakt mit der Mikrotubuli gebracht wird, in Gegenwart von sättigenden (1 mm) ATP. Der Motor zum Mikrotubuli befestigt ist, und ging weg von der Mitte des Laserfalle. Auf einen vordefinierten Verschiebung des Wulstes von dem Trap-Zentrum (100 nm) die Laserstrahlleistung wurde automatisch ausgeschaltet, und der Motor entlang der MT im Leerlauf laufen. Der Film zeigt einen 500 nm Durchmesser Perle mit Einzel-Kinesin entlang MT. Die Länge des Video-Bildschirms entspricht 20 um. Abbildung 3 stellt die gemessene Verteilung der Lauflängen für Single in voller Länge Drosophila Kinesin-Moleküle, gereinigt nach dem Protokoll hier vorgestellten. Die exponential auf die Verteilung passen liefert die durchschnittliche Lauflänge der einzelnen Kinesin 1,55 ± 0,1 um und 1,28 ± 0,12 um für das gefilterte und ungefilterte Probe sind. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig1.jpg" alt="1" /> 1 Silber angefärbten Gels der gereinigten Fraktionen. Proben von jeder Fraktion wurden in einem 10%-Gel durchgeführt. 10 ug Protein wurde in jede Spur geladen. Spur 1 ist ein Beispiel für die Hochgeschwindigkeits-Überstand nach Klärung (Schritt 2.5), Spur 2 eine Probe des Pellets nach Klärung, ist Bahn 3 eine Probe des Überstandes nach der ersten Sedimentation mit Saccharose-Kissen (Schritt 4.1), Spur 4 wird eine Probe von dem Pellet nach der ersten Sedimentation, Bahn 5 ist eine Probe des Überstandes nach der zweiten Sedimentation (Schritt 4.3), Spur 6 eine Probe des Pellets nach dem zweiten Sedimentation, Spur 7 ist eine Probe des Pellets von Die Nachklärbecken (Schritt 4.5), Spur 8 ist das gereinigte KinesinBeispiel ist die Spur 9 filtriert Kinesin unter Verwendung eines 100 kD Cut-off Amicon Ultra 0,5 ml Filterzentrifuge (Millipore, USA). Die blauen Pfeile zeigen die Proteine, deren Beträge wurden verringert und der rote Pfeil zeigt die Konzentration des Kinesin aufgrund der Zentrifugalfiltration Schritt in diesem Protokoll verwendet. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig2.jpg" alt="2" /> . 2 Gereinigtes KHC Fraktion geblottet gegen Anti-Kinesin-Antikörper: Gereinigtes Kinesin Probe wurde einer Gelelektrophorese unterzogen und geblottet (in Nitrocellulosemembran) gegen primäre Antikörper AKINO1-A (1:1000 in TBST) für 1 Stunde bei Raumtemperatur gefolgt von Inkubation in Esel-anti-Kaninchen-Antikörper (1:10.000 in TBST) für eine Stunde bei Raumtemperatur. Ein ECL (Chemilumineszenz) Kit wurde verwendet, um das Signal Kinesin oben gezeigt zu erkennen. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. </strong&gt; Lauflänge und die Geschwindigkeit des einzigen Drosophila Kinesin in voller Länge: (A) und (B) Lauflänge und die Geschwindigkeit des gefilterten Kinesin-Probe. (C) und (D) Lauflänge und die Geschwindigkeit des ungefilterten Kinesin Probe. Abbildung 4. Video von Kinesin Motilität. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3501/3501movie4.avi" target="_blank">Hier klicken, um Video anzusehen</a> .

<ol>
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Wir haben nichts zu offenbaren.

Rinderhirn ist das am häufigsten verwendete Ausgangsmaterial 11 bis voller Länge Kinesin zu reinigen, wenn murine Gehirn und 12 verwendet wurden. Ein großer Nachteil der Verwendung von Rinder-Hirn als Kinesin-Quelle ist die Verfügbarkeit von frischem Ausgangsmaterial: Schlachthöfe sind in der Regel nicht zugänglich, und das Gehirn muss sehr frisch, um aktiv Kinesin zu erhalten. Weiterhin sind nur die Gehirne der jungen Kühe wirksam. Schließlich ist Genmanipulation von Kühen zur Zeit keine ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes oder Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Agar (granuliert) </td><td> Fischer </td><td> 1423-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose (D-Glucose) Wasserfreies </td><td> Fischer </td><td> D16-3 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischalen </td><td> Becton </td><td> 35 1007 </td><td> 60x15mm Stil (Polyester) 20/bag </td></tr><tr><td> Drosophila Culture Fläschchen </td><td> UCI </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tricorn Becherglas </td><td> Econo Lab Inc. </td><td> B700-100 </td><td> Volumen: 100 ml, Größe: 58x72mm </td></tr><tr><td> Hefe </td><td> Red Star </td><td> 2751 </td><td></td></tr><tr><td> Nylon-Mesh </td><td> Genesse Scientific </td><td> 57-102 </td><td> 120 mIcron Porengröße </td></tr><tr><td> Nylon-Mesh </td><td> Kleinteile </td><td> 06-350/35 </td><td></td></tr><tr><td> Pipes </td><td> Sigma </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> Pipes </td><td> Sigma </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> Glycerin </td><td> Fischer </td><td> 56-81-5 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> 67-42-5 </td><td></td></tr><tr><td> MgS0 4 (wasserfrei) </td><td> Fischer </td><td> 7487-88-9 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Sigma </td><td> 329-98-6 </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=103476-89-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">103476-89-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> Aprotonin </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=9087-70-1&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">9087-70-1</a> </td><td></td></tr><tr><td> TAME </td><td> Sigma </td><td> 178403-8 </td><td></td></tr><tr><td> STI </td><td> Calbiochem </td><td> 65635 </td><td></td></tr><tr><td> GTP </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=36051-31-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">36051-31-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> Taxol </td><td> Sigma </td><td> 33069-62-4 </td><td></td></tr><tr><td> ATP-Analogon 5&#39;-Adenylat Imidodiphosphat </td><td> Sigma </td><td> 3605-31-7 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7647-14-5 </td><td></td></tr><tr><td> ATP </td><td> Sigma </td><td> 74804-12-9 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra-Zentrifugalmühle Filter: 0,5 mL, 100 kD abgeschnitten, 8 Stück </td><td> Millipore </td><td> UFC510008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and purification of kinesin from drosophila embryos

Motorproteine ​​bewegen Ladungen entlang von Mikrotubuli, und transportieren sie zu spezifischen subzellulären Orten. Aufgrund veränderter Transport wird vorgeschlagen, eine Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen zugrunde liegen, verstehen Mikrotubuli beruht Kraftverkehrs und dessen Regulierung dürfte letztlich zu einer verbesserten therapeutischen Ansätzen führen. Kinesin-1 ist ein Motor eukaryotischen Protein, das in eine anterograde (Plus-Ende) entlang Mikrotubuli (MT), durch ATP-Hydrolyse bereitgestellt bewegt. Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll zur aktiven Reinigung voller Länge Kinesin von Drosophila-Embryonen zu isolieren, so dass die Kombination von Drosophila-Genetik mit Einzel-Molekül-biophysikalische Untersuchungen. Beginnend mit ca. 50 Tassen legen, mit etwa 1000 Frauen pro Tasse, haben wir über Nacht Sammlungen. Dies lieferte ungefähr 10 ml gepacktes Embryonen. Die Embryonen waren Bleichmittel dechorionated (was ungefähr 9 Gramm Embryonen), und dann homogenisiert. After Störungen, wurde das Homogenat geklärt mit einer langsam laufenden Spin durch eine Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation. Der geklärte Überstand wurde mit GTP und Taxol behandelt, um MTs zu polymerisieren. Kinesin wurde auf polymerisierten MTs mit indem die ATP-Analogon, 5&#39;-Adenylat Imidodiphosphat bei Zimmertemperatur immobilisiert. Nach Kinesin bindend, wurden Mikrotubuli über Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation durch ein Saccharose-Kissen sedimentiert. Die Mikrotubuli Pellet wurde dann erneut suspendiert, und dieses Verfahren wurde wiederholt. Schließlich wurde hinzugefügt, um die ATP-Kinesin aus dem MTs freizugeben. Hochgeschwindigkeitszentrifugation dann abzentrifugiert der MTS, dem Verlassen des Kinesin im Überstand. Diese Kinesin einer zentrifugalen Filtration mit einem 100 KD-Sperrfilter für die weitere Reinigung unterzogen wurde, aliquotiert, in flüssigem Stickstoff gefroren und bei -80 ° C SDS-Gelelektrophorese und Western Blotting wurde unter Verwendung des gereinigten Probe. Die motorische Aktivität der gereinigten Proben vor und nach dem letzten Schritt Zentrifugalfiltrationwurde unter Verwendung eines in vitro-Assay einzelnes Molekül Mikrotubuli. Die Kinesin Fraktionen vor und nach der Zentrifugalfiltration zeigten Prozessivität wie zuvor in der Literatur berichtet. Weitere Versuche sind im Gange, um die Interaktion zwischen Kinesin und anderen Verkehrsmitteln verwandten Proteinen zu evaluieren.

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Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Dies ist ein Protokoll, um aktiv in voller Länge zu isolieren Kinesin aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen für die Einzel-Molekül-biophysikalische Untersuchungen. Wir zeigen, wie man Embryonen zu sammeln, machen den Embryo-Lysat, und dann polymerisieren Mikrotubuli (MT). Kinesin ist durch Immobilisierung auf der MTS, Spinning Festlegung der Kinesin-MT-Komplexe, und dann die Freigabe der Kinesin aus dem MTS via ATP zusätzlich gereinigt.

Isolierung und Reinigung von Kinesin aus Drosophila Embryonen

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

isolation-and-purification-of-kinesin-from-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

12.1K Aufrufe.  University of California, Irvine. Dies ist ein Protokoll, um aktiv in voller Länge zu isolieren Kinesin aus Drosophila Embryonen für die Einzel-Molekül-biophysikalische Untersuchungen. Wir zeigen, wie man Embryonen zu sammeln, machen den Embryo-Lysat, und dann polymerisieren Mikrotubuli (MT). Kinesin ist durch Immobilisierung auf der MTS, Spinning Festlegung der Kinesin-MT-Komplexe, und dann die Freigabe der Kinesin aus dem MTS via ATP zusätzlich gereinigt.

Serie: Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Vorbereitung der neuronalen Kulturen aus Midgastrula Bühne Drosophila Embryonen

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Forschung

Biologie

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolierung von CD4 + T-Zellen aus Maus-Lymphknoten mit Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolierung und Reinigung von Drosophila Peripheren Neuronen durch Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo-Zentrifugation von Drosophila Embryonen

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Upright Imaging von Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Primären Zellkulturen aus Drosophila Gastrula Embryonen

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Reinigung von Transcripts und Metaboliten aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Köpfe

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...