Selbst sehr frühe Embryonen enthalten viele verschiedene Signalmoleküle, was es schwierig machen kann, die vollständige Funktion eines einzelnen embryonalen Signals zu erkennen. Durch die Isolierung von Zellen aus endogenen Signalzentren ermöglichen diese Explantaten den Forschern, die Rolle eines bestimmten Signalmoleküls in relativer Isolation zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir in der Lage sind, embryonales Timing, Zellbewegungen und Genexpressionsmuster innerhalb eines vereinfachten Ex-vivo-Systems zu rekapitulieren, ohne die Zeit oder den Aufwand, der erforderlich ist, um Stammzellen in Kultur zu halten.
Beginnen Sie damit, zuerst die Explantate aus den nicht infizierten Embryonen zu schneiden. Wenn die Explantate die Kultur verlängern, dann wurde der Schnitt so nahe am Eigelb gemacht. Beginnen Sie mit dem Füllen einer gezogenen Glaskapillarnadel mit RNA.
Legen Sie die gefüllte Nadel in einen Mikromanipulator und brechen Sie die Nadelspitze mit der Pinzette. Kalibrieren Sie das Injektionsvolumen mit einem Tischmikrometer mit einem Tropfen Mineralöl und passen Sie die Injektionszeit und den Druck auf den pneumatischen Injektor an, um einen Bolus der gewünschten Größe zu erreichen. Halten Sie die RNA-Nadelspitze im Öl eingetaucht, bis sie zum Injizieren bereit ist.
Laden Sie die Embryonen mit einer Pasteur-Pipette und einer Pipettenpumpe in die Injektionsplatte und drücken Sie die Eier dann mit einem behandschuhten Finger vorsichtig in die Mulden. Injizieren Sie 10 Pikogramm ndr2 RNA in das Eigelb von einzelligen Embryonen, bis die gewünschte Anzahl von Embryonen erreicht ist oder bis sich die Embryonen zu teilen beginnen. Verwenden Sie einen sanften Strom von Eiwasser aus einer Quetschflasche, um die Embryonen aus der Injektionsplatte in eine beschriftete Petrischale zu waschen.
Legen Sie die Embryonen in den 28,5 Grad Celsius großen Inkubator, bis sie das 128-Zell-Stadium erreicht haben. Entfernen Sie unbefruchtete Eier und tote Embryonen aus der Schale. Sobald die Embryonen das 128-Zell-Stadium erreicht haben, legen Sie sie in beschriftete Glas-Petrischalen und dekantieren Sie so viel Eiwasser wie möglich aus ihnen.
Beschriften Sie glaskristallisierende Schalen mit Laborklebeband, das kleinen Schalennamen entspricht, und füllen Sie zwei Drittel des Weges mit Eiwasser. Platzieren Sie diese Schalen neben dem Seziermikroskop für eine schnelle Zugänglichkeit. Fügen Sie einen Milliliter à 20 Milligramm pro Milliliter Pronasevorrat, aufgetaut auf Eis, zu 15 Millilitern 3X Danieaus Lösung in einem 50 Milliliter konischen Röhrchen hinzu.
Fügen Sie mindestens fünf Milliliter Pronaselösung in jede Glas-Petrischale mit Embryonen hinzu. Rühren Sie die Glasschalen in einer kreisförmigen Bewegung und überwachen Sie den Fortschritt der Dekationierung konsequent unter einem Seziermikroskop. Sobald die Chorionen zu knittern beginnen und ein bis zwei Embryonen aus ihren Chorionen heraus sind, tauchen Sie vorsichtig die Glas-Petrischale mit Pronase und die Embryonen in die entsprechende Glaskristallisationsschale mit Eiwasser.
Waschen Sie die Dekationierungsembryonen dreimal mit Eiwasser und dekantieren Sie das Eiwasser aus der Schale. Führen Sie die dritte und letzte Wäsche mit der 0,3-fachen Lösung von Danieau durch. Bedecken Sie die dehorionierten Embryonen mit einem Petrischalendeckel und bringen Sie sie bei 28,5 Grad Celsius in den Inkubator zurück, bis sie das 256-Zell-Stadium erreicht haben.
Füllen Sie eine mit Agarose überzogene Petrischale mit 3X Danieaus Lösung. Sobald sich die Embryonen im 256-Zell-Stadium befinden, übertragen Sie sie in die mit Agarose beschichtete Platte, die 3X Danieaus Lösung enthält, und richten Sie sie entlang der Mitte der Schale aus. Verwenden Sie eine Pinzette, die geschlossen gehalten wird, um den Embryo zu stabilisieren, und verwenden Sie die andere, um durch das Blastoderm zu schneiden.
Zum Schneiden drücken Sie die Blastodermzellen vorsichtig mit einer Pinzette zusammen, nehmen Sie dann die stabilisierende Pinzette und führen Sie sie entlang der anderen Pinzette, um ungefähr die Hälfte über die Blastoderme zu schneiden. Drehen Sie den Embryo, legen Sie die Pinzette in den vorhandenen Schnitt und trennen Sie dann die verbleibende Blastoderme orthogonal zum ersten Schnitt. Bewahren Sie explantierte Pflanzen mindestens fünf Minuten lang in der Lösung von 3X Danieau auf, um sie zu heilen, und geben Sie sie dann in den mit Agarose beschichteten Brunnen einer Sechs-Well-Platte, die mit vier Millilitern explantierten Medien gefüllt ist.
Legen Sie die explantierten Kulturplatten in den 28,5 Grad Celsius heißen Inkubator, bis der gewünschte Zeitpunkt oder das gewünschte Stadium erreicht ist. Um die chimären Explantate zu schneiden, verwenden Sie eine Schale mit Agarose, die mit einem Millimeter Glasperlen in 12 kleine flache Vertiefungen geformt wurde. Füllen Sie die Platte mit der Lösung von 3X Danieau.
Bereiten Sie sich vor, indem Sie 12 Embryonen eines Genotyps oder Zustands auf der linken Seite der Platte hinzufügen, und 12 Embryonen des anderen Genotyps werden auf der rechten Seite der Platte konditioniert. Bewegen Sie einen Embryo jeder Erkrankung in die Mitte der Platte in der Nähe einer der 12 Vertiefungen. Schneiden Sie mit einer Pinzette aus jedem Embryo eine Explantate ab, wie für einzelne Embryo-Explantate beschrieben.
Drücken Sie schnell die Schnittkanten der beiden Explantaten innerhalb des flachen Brunnens mit einer Pinzette zusammen, damit die beiden Hälften zusammen zu einer einzigen Explantation heilen können. Fahren Sie mit den verbleibenden 12 Vertiefungen innerhalb der Platte fort. Sobald die Explantate verheilt sind, geben Sie sie in den mit Agarose beschichteten Brunnen einer Sechs-Well-Platte, die mit vier Millilitern explantierter Medien gefüllt ist.
Wiederholen Sie den Vorgang, bis die gewünschte Anzahl von Expflanzen erreicht ist. Kultur explantiert im 28,5 Grad Celsius heißen Inkubator, bis intakte Geschwisterembryonen das gewünschte Stadium erreicht haben. Kontrollexplantate, die aus den nicht infizierten Wildtyp-Embryonen geschnitten wurden oder denen 50 Pikogramm mRNA injiziert wurden, die für grün fluoreszierendes Protein kodieren, blieben während des gesamten Kulturzeitraums abgerundet und konnten keine Marker für Mesoderm, Endoderm oder Neuroektoderm exprimieren.
Explantate, die aus Embryonen geschnitten wurden, denen 10 Pikogramm ndr2 mRNA injiziert wurden, wurden nach acht bis neun Stunden in Kultur stark verlängert. Live-Zeitrafferaufnahmen dieser Explantate durch differentielle interferierende Kontrastmikroskopie zeigten, dass die Verlängerung bei oder etwa acht Stunden nach der Befruchtung einsetzt. Explantate aus Embryonen, denen 10 Pikogramm ndr2 injiziert wurden, zeigten eine robuste Expression der Mesodermmarker tbxta, noto, tbx16 und des Neuroektoderm-Markers sox2.
Es ist sehr wichtig, die Explantaten weit über dem embryonalen Rand zu schneiden. Andernfalls enthalten die Explantate endogene Signale vom Rand und sind nicht naiv. Bei dieser Methode wurden Explantaten verwendet, um die Rolle der Knotensignalisierung bei der Gastrulationsmorphogenese zu untersuchen.
In Zukunft können andere Forscher mit diesem Ansatz die Rolle zusätzlicher Signalmoleküle beispielsweise in beliebig vielen Entwicklungsprozessen testen.
