Eine der Herausforderungen in der Netzhautforschung besteht darin, den Austausch zwischen verschiedenen Zellen wie Netzhautneuronen, Gliazellen und Gefäßzellen zu untersuchen. Insbesondere die Isolierung und Kultivierung von Netzhautneuronen ist eine Herausforderung. Wir glauben, dass kultivierte Netzhautexplantate diese Einschränkung überwinden und ein einzigartiges Ex-vivo-System bieten können, das es uns ermöglicht, das Crosstalk zwischen verschiedenen Netzhautzellen unter gut kontrollierten biochemischen Parametern und unabhängig vom Gefäßsystem zu untersuchen.
Auch eine Netzhautexplantat ist ein prominentes Screening-Werkzeug, um neuartige pharmakologische Interventionen bei verschiedenen retinovaskulären und neurodegenerativen Erkrankungen wie der diabetischen Retinopathie zu untersuchen, die durch vaskuläre und neuronale Verletzungen gekennzeichnet ist. Unser Labor untersucht seit Jahren pathophysiologische Veränderungen, die mikrovaskuläre Netzhautdysfunktion fördern. Die Verwendung einer Vielzahl von Modellen, einschließlich In-vivo- und In-vitro-Modellen, ermöglichte es uns, viele Techniken in unserem Labor zu optimieren.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für Netzhautexplantate aus einer erwachsenen Wildtyp-Maus, die zwei Wochen in Kultur gehalten werden kann. Halten Sie die Tiere unter konstanter Temperatur und lichtkontrollierter Umgebung. Untersuchen Sie jedes Tier auf Gesundheit, ausreichende Nahrung und Wasser.
Stellen Sie sicher, dass Sie die Tiere mit frischem Futter und sauberem Wasser versorgen. Wechseln Sie verschmutzte Käfige täglich oder nach Bedarf für die Gesundheit der Tiere. Verwenden Sie männliche schwarze 6 Mäuse im Alter von mehr als 12 Wochen.
Euthanasieren Sie die Tiere in ihrem Heimkäfig durch Kohlendioxid-Überdosis-Inhalation. Nach Abschluss des Verfahrens bestätigen Sie den Tiertod durch eine geeignete Methode, z. B. die Bestätigung eines Herz- und Atemstillstands oder die Beobachtung fester und erweiterter Pupillen des Tieres. Folgen Sie der Todesbestätigung durch eine sekundäre Methode der Euthanasie wie zervikale Dislokation.
Üben Sie mit einer gekrümmten Pinzette Druck auf die Umlaufbahn aus, bis der Globus hervorsteht. Schließen Sie die Pinzette vorsichtig am hinteren Teil des Auges und heben Sie sie in einer kontinuierlichen Bewegung an. Tauchen Sie den Augapfel in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, das ein Milliliter eiskaltes HBSS enthält.
Übertragen Sie den Augapfel in ein 1,5- oder Zwei-Milliliter-Röhrchen, das komplette Medien enthält. Jetzt ist es bereit für die Sektion. Dieses Diagramm veranschaulicht die aufeinanderfolgenden Schritte, die zum Sezieren des Mausaugapfels gezeigt werden, um die Netzhautexplantat zu erzeugen.
Ein umlaufender Schnitt wird entlang des Limbus gemacht, um den Augapfel zu öffnen. Die Hornhaut wird durch Sezieren entlang des limbalen Schnittes entfernt. Die Linse und der Glaskörper werden dann entfernt, so dass eine leere Augenmuschel übrig bleibt.
Durch das Halten der Region des Sehnervenkopfes mit der feinen Pinzette erfolgt das Abziehen der äußeren Augenschicht schonend. Große Aufmerksamkeit bei der Entfernung der äußeren Hülle, um die neuronale Netzhaut nicht zu verletzen und die Netzhaut vollständig intakt zu haben. Dann wird die Netzhaut in kleinere Stücke geschnitten.
Dies wird ein großer Vorteil sein, da Sie ein Experiment durchführen können, bei dem Ihre Kontrollgruppe und Ihre Versuchsgruppen vom selben Tier stammen. Das Schneiden der Netzhaut in kleine Stücke macht die Handhabung jedoch schwieriger. Daher haben wir eine Technik für den Umgang mit diesen kleinen Netzhautstücken entwickelt, um die richtige Ausrichtung der Netzhautkultur zu gewährleisten.
Gehen Sie mit der sezierenden Scherenklinge, die direkt unter dem Netzhautstück geöffnet ist. Heben Sie das Netzhautstück langsam mit der Spitze einer offenen Scherenklinge an und übertragen Sie es vorsichtig auf die Kulturplatte. Die Explantate werden separat auf Zellkultureinsätze in Multi-Well-Platten übertragen, von denen jede 300 Mikroliter retinale Explantatmedien mit der neuralen Netzhautseite nach oben enthält.
Netzhautexplantatkulturen werden in befeuchteten Inkubatoren bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid gehalten. Stellen Sie sicher, dass die Netzhautoberfläche nach oben zeigt. Wenn das Netzhautstück umgedreht oder gefaltet wird, versuchen Sie, es vorsichtig in die richtige Ausrichtung einzustellen.
Wenn die Netzhautexplantat nicht in die richtige Ausrichtung gebracht wird, wobei die neuronale Netzhaut nach oben zeigt, führt dies zum Versagen des richtigen Wachstums der Netzhautzellen in Kultur. Hier können wir sehen, wie die Immunfluoreszenz die in Kultur gefärbten Netzhautexplantate für zwei Wochen färbt. Die Explantate wurden fixiert und mit NeuN für retinale Neuronen, GFAP für Gliazellen und Lektin für Blutgefäße gefärbt.
Die Färbung zeigte gut entwickelte Netzhautzellen und Netzhautgefäße. Hier können wir Immunfluoreszenzfärbung von Netzhautexplantaten sehen, die mit GFAP für Gliazellen und Lektin für Blutgefäße fixiert und gefärbt wurden. Die Bilder zeigen eine fehlerhafte Färbung und Unterentwicklung sowohl der Netzhautzellen als auch der Netzhautgefäße.
Dies liegt daran, dass die Netzhautexplantat gefaltet war und nicht richtig auf der Kulturplatte ausgerichtet war. Große Aufmerksamkeit sollte auf die richtige Ausrichtung der Explantat mit der Netzhaut nach oben gelegt werden. Da die Kontrollgruppe von demselben einzigen Tier wie die behandelte Gruppe stammt, ist es von großem Vorteil, einen zuverlässigeren Vergleich verschiedener Versuchsbedingungen zu haben.
Netzhautimplantate können eine gute Plattform für die Untersuchung möglicher therapeutischer Ziele für eine Vielzahl von Netzhauterkrankungen wie diabetische Retinopathie und degenerative Netzhauterkrankungen bieten.
