Name: an acute retinal model for evaluating blood retinal barrier breach and potential drugs for treatment
Uploaded: 2016-09-13T15:00:00.000+00:00
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Bringhurst Meats (Berlin, NJ) is acknowledged for their genuine help in providing the swine eyeballs.

Alle Protokolle wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institutional Animal Care und Use Committee gegebenenfalls durchgeführt. 1. Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie die Stabilisierungsmedien mit 75% Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM), 25% Hanks &#39;Balanced Salt Solution (HBSS). Gut mischen, aliquotieren und bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Bereiten Sie die Phosphat-gepufferte Saline (PBS) und durch Autoklavieren sterilisieren. Bewahren Sie die Lösung bei Raumtemperatur. Erwärmen Sie den PBS auf 37 ° C vor dem Experiment (5 ml pro Vertiefung). </li><li> Herstellung von 10%, 20% und 30% Saccharose in PBS. Filter alle Lösungen einzeln über getrennte 0,22 um Filter für die Sterilisation. Speichern Sie die Lösungen bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie die Histamin-Stammlösung in PBS auf eine Konzentration von 90 mM. Sterilisieren der Lösung durch Filtration über ein 0,22-um-Filter. Aliquot und die Lösung bei -80 ° C zu speichern. Vermeiden Sie mehrere Gefrier-und-Auftau-Zyklen. </li><li> Machen Sie frisch 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS vor dem Experiment. Legen Sie sie auf Eis. Vorsicht: Halten Sie PFA in einem Abzug und tragen Sie geeignete Schutzausrüstung. </li><li> Auftauen Stabilisierungsmedium (20 ml pro Retina). Hinzufügen, Penicillin-Streptomycin in einer Endkonzentration von 100 U / ml. Warmen Teil des Mediums (15 ml pro Retina) bis 37 ° C im Inkubator vor dem Experiment. Lassen Sie den Rest des Mediums auf dem Eis. </li><li> Legen Sie die HBSS (10 ml pro Retina) auf Eis. </li></ol> 2. Retinal Organotypischen Kultur <ol><li> Übertragen Sie die Proben auf eine Gewebekultur Kapuze. Öffnen Sie die Augenmuschel von rund um das Objektiv zu schneiden. Mit einer Bürste, entfernen Sie den Glaskörper ohne auf der Netzhaut zu ziehen. Vorsichtig lösen mit einem Pinsel auf die Netzhaut von der Schnittkante der Papille zu belichten. Schwere der Sehnerv mit einer Rasierklinge und die Netzhaut lösen. </li><li> Übertragen Sie die Netzhaut in eine Petrischale und sorgfältig auf die Netzhaut einmal mit kaltem HBSS spülen. Die Probe wird in HBSS auf ice. nach Bedarf Präparieren wie viele Netzhäuten aus Schritt 2.1 und dieser Schritt wird wiederholt. </li><li> Schneiden Sie die Netzhaut in zwei Hälften symmetrisch mit einem Rasiermesser. Sanft übertragen Proben auf eine 6-Well-Platte mit 3 ml Stabilisierung Medien pro Vertiefung. Erlauben Äquilibrierung für 30 min bei 37 ° C in einem Inkubator mit der Atmosphäre , die 5% CO 2. </li><li> Bereiten Sie die folgenden Reagenzien während der Inkubation bei Schritt 2.3: Verdünnen Sie die Histamin-Stammlösung auf die gewünschte Konzentration (450 &amp; mgr; M) in warmem Medium. Auflösen LXA4 (gespeichert unter Argon) in das Medium bis zu einer Endkonzentration von 250 ng / ml. HINWEIS: Wenn die Wirkung von LXA 4 zu messen, die eine Hälfte von einer einzigen Netzhaut für Histamin allein verwendet wird, während die andere Hälfte für Histamin mit LXA 4 verwendet wird. </li><li> Saugen Sie das Stabilisierungsmedium sorgfältig und fügen Sie das fertige Medium zu jeder Vertiefung (3 ml pro Vertiefung). Inkubieren der Proben bei 37 ° C für 1 h in einem Inkubator mit der Atmosphäre , die 5% CO 2. </li><li> Spülen Sie dieProben einmal in warmen, sterilen PBS. </li></ol> 3. Bereiten Sie die Proben für Immunostaining <ol><li> Absaugen PBS von den Platten. In 4% PFA (3 ml pro Vertiefung) und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Schnell die PFA absaugen. Spülen Sie die Proben einmal mit PBS. Übertragen Sie die Proben auf 10% Sucrose (5 ml pro Vertiefung) und Inkubation für 2 bis 4 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Übertragen Sie die Proben auf ein 30% Sucrose (5 ml pro Vertiefung) und Inkubation über Nacht bei 4 ° C. Mischen Sie einen Teil des kommerziellen Einfriermedium mit zwei Teilen von 20% Saccharose das Arbeits Einfriermedium zu machen. Lassen Sie es bei 4 ° C über Nacht oder länger, bis die Luftblasen verschwinden. </li><li> Übertragen Sie die Proben auf das Arbeits Einfriermedium und ermöglichen Äquilibrierung während 5 min bei Raumtemperatur. Schneiden Sie jede Netzhaut in Rechtecke (ca. 3 mm bis 5 mm). </li><li> übertragen Sie sorgfältig die Proben in die Arbeits Einfrieren Medien in einem zylindrischen Behälter enthalten sind (etwa 1 cm Radius x 2 cm Höhe) devISED aus Aluminiumfolie. Stellen Sie sicher, dass die Netzhaut Scheiben vertikal sind (orientiert einen Querschnitt der Netzhaut zu schaffen, auf sectioning) und frieren sie in flüssigem Stickstoff. Speichern Sie die Blöcke bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Abschnitt jeder Block auf einem Kryostaten in 14 &amp; mgr; m dicke Scheiben schneiden und montieren Sie die Abschnitte auf Glasplatten. Lagern Sie die Folien bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 4. Immunostaining <ol><li> Waschen der Schnitte mit 5% Sucrose Phosphatpuffer (SPB, 5% Saccharose in PBS, pH 7,4) einmal. Blockieren die nicht-spezifischen Bindungsstellen durch Inkubation der Abschnitte in Blockierungspuffer (5% SPB mit 10% normalem Ziegenserum und 0,5% Triton X-100) 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren Sie die Abschnitte (auf Folien) mit dem entsprechenden primären Antikörper (GFAP oder MAP2, verdünnt auf 1: 500 in Blocking-Puffer) für 1 Stunde. Absaugen die Lösung. Waschen dreimal in 5% SPB. Für die endogene IgG-Färbung, diesen Schritt überspringen. </li><li> Inkubieren Sie die Abschnitte mit dem entsprechenden SECON1 h: dary Antikörper (800 in Blockierungspuffer bei 1 Cyanine3 / FITC konjugiertem Esel-anti-Maus / anti-Kaninchen-IgG, verdünnt). </li><li> Waschen Sie die Abschnitte gründlich mit 5% SPB dreimal. Bereiten Sie die Proben für die Mikroskopie von ihnen Montagemedium, das DAPI in Montage und Abdecken mit Deckgläsern. </li><li> Mit einem Laser konfokalen Mikroskop, die Aufnahmen über ein 20fach - Objektiv unter identischen Parametern wie Laserintensität, Gain - Wert, Verweilzeit usw. in Gruppen. Festlegen der Anregungs- / Emissionswellenlängen für den blauen Kanal (zu detektieren DAPI) als 408/447 nm, für den roten Kanal (zu detektieren Cyanine3) als 561/785 nm und für den grünen Kanal (zu erkennen FITC) als 488/525 nm . </li></ol> 5. Bildanalyse <ol><li> Quantifizieren Prozentsatz von undichten Blutgefäße nach den folgenden Kriterien 12: Geben Sie nur die Blutgefäße mit endothelialen Zellkerne innerhalb der Ebene des Abschnitts in der Zählung; ein Blutgefäß undicht prüfen, ob es ag zeigtradient der Immunfärbung des Behälters umgibt. </li><li> Um das Expressionsniveau bestimmen, wählen Sie Bereiche von Interesse und messen Sie den mittleren Grauwert unter Verwendung der Bildanalyse-Software. </li><li> Um die Breite des Prozesses zu messen, einen Bereich des Abschnitts zu wählen, wo die Prozesse unterscheiden (die äußere Kernschicht, ONL, zum Beispiel). Dann wählen Sie ein optisches Feld, wo solche Prozesse sichtbar und kontinuierlich sind. Stellen Sie den Maßstab entsprechend der mikroskopischen Einstellung, eine Linie über den Prozess ziehen und die Messung durchzuführen. </li><li> Um die Kontinuität des Prozesses, wählen Sie Bereiche von Interesse zu analysieren, wenden Sie den Filter genannt Varianz, die die Kanten im Bild verbessert, indem jedes Pixel mit seiner Nachbarschaft Varianz zu ersetzen, passen sich automatisch den Kontrast und die Helligkeit, die Linien zu zählen und die Zählung durch die Normalisierung Bereich. </li><li> Berechnen statistische Bedeutungen unter Verwendung eines two-tailed t - Test nach Student. * P &lt;0,05; ** P &lt;0,01; *** P &lt;0,001. Plot das Ergebnis als Mittelwert ± SEM. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

In this report, we present a powerful ex vivo acute retinal model of BRB dysfunction using the swine retina. This model system does not require special instruments and can be easily adapted under most laboratory settings. However, to obtain a successful result, several steps require close attention. After obtaining the eyeballs from the source, they must be kept at 4 &#176;C or on ice and processed as soon as possible. When the effect of a treatment is being analyzed, two halves of the same retina must be used -...

Eine wachsende Zahl von Hinweisen unterstützt die Existenz von Blut Retina - Schranke (BRB) 1-5 und seine Ähnlichkeit mit dem Blut - Hirn - Schranke (BBB) ​​6,7. Kompromiss der BBB wurde ursächlich oder als diagnostischer Marker für chronische neurodegenerative Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit (AD) 8,9 und akuter Erkrankungen wie Delirium 10 fest verbunden. Mechanistische Einblicke in diese Pathologien und Entdeckungen für potentielle Arzneimittelziele werden durch die begrenzte Zugänglichkeit und Netzwerk Kompliziertheit des Gehirns im Allgemeinen behindert. Alternativen , wie beispielsweise in vivo - Bildgebung 11, Gehirn organotypische Kultur 12, primären Zellkulturen 13,14 und Co-Kultursysteme 15 erzeugt worden sind . Allerdings sind die meisten dieser Modelle erfordern spezielle Instrumente, lange Versuchszeiten oder mehrere Marker-Zellen zu identifizieren. Funktionelle und strukturelle Ähnlichkeiten zwischen BBB und BRB sowie eine Korrelation zwischen der dysfunctions der beiden wurden 16-19 argumentiert. Zusätzlich leichteren Zugang, gut definierte Zelltypen und eine Schichtstruktur haben, die gut charakterisierten Netzhaut als ein Fenster zum Gehirn erlaubt. Die strukturellen und funktionellen Identität der BBB und BRB bleiben im Detail verglichen werden. Jedoch retinale Pathologien, insbesondere die BRB Verletzung, wurden ebenfalls mit dem Fortschreiten von verschiedenen Krankheiten eng in Verbindung gebracht worden, einschließlich Diabetes 18-19 und AD 21,22. Somit ist es von Interesse, eine BRB Dysfunktion System zu etablieren, nicht nur den Mechanismus zu beschreiben, sondern auch potentielle Arzneimittel zu screenen. In diesem Bericht wird ein Protokoll ermöglicht BRB Dysfunktion eine einfache akute retinale Kultur unter Verwendung entwickelt und präsentiert. Erhöht BBB Permeabilität und AD-ähnliche pathologische Veränderungen wurden in einem Gehirn organotypischen Kultur etabliert mit Histamin inkubiert, einem pro-inflammatorischen Mediators 12. Daher wird in dem dargestellten System war Histamin applied zur ex - vivo - Retinal Kultur BRB Dysfunktion zu induzieren. Retinas von mehreren Arten, wie Mus musculus und Bos Taurus, getestet wurden. Aufgrund ihrer kommerziellen Verfügbarkeit und Ähnlichkeit mit menschlichem Gewebe, frisch wurden Schweine Augäpfel verwendet, um die Daten hier berichtet zu liefern. Nach Inkubation mit Histamin und / oder andere Medikamente wurden die Retinas zur Auswertung verarbeitet durch Immunfärbung für mehrere Proteine ​​12, wie Immunoglobulin G (IgG), eine der Hauptkomponenten des Blutes; glial fibrillary acidic protein (GFAP), ein bekannter Marker für Gliazellen Aktivierung; und Mikrotubuli-assoziierten Protein 2 (MAP2), ein Neuron-spezifischen Zytoskelettprotein essentiell für Mikrotubuluszusammenbau. Darüber hinaus ermöglicht die geschichtete Struktur der Netzhaut, eine detaillierte Analyse der Prozesse der Müller-Zellen und Ganglionzellen, wie beispielsweise Veränderungen in ihrer Breite und Kontinuität. So einige zusätzliche Parameter zur Verfügung, die Folgen der zu bewertenBRB Verletzung in einem frühen Stadium und auch die Umkehrung Auswirkungen möglicher Behandlungen zu bewerten. In diesem Protokoll werden mögliche Umkehrung Wirkungen gescreent Drogen aus drei Perspektiven bewertet: das Austreten von Blutgefäßen (BVs), die Aktivierung von Gliazellen und beschädigungs Reaktion von neuronalen Zellen. Mehrere Quantifizierungsverfahren werden verwendet, zum Beispiel die Expressionsniveaus von einem Verbesserungsfilter dargestellt durch Intensität der Immunfärbung Breitenmessung eines Prozesses und die Kontinuität der neuronalen Prozesse gezeigt. Zum besseren Verständnis der Methode veranschaulichen und zu helfen , Ergebnisse zu interpretieren, Lipoxin A4 (LXA 4) eine Verbindung synthetisiert endogen als Reaktion auf entzündliche Verletzungen und mildernde endotheliale Dysfunktion 23, wurde zu Demonstrationszwecken gewählt.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>J.T.Baker</td><td>4072-05</td><td></td></tr><tr><td>Histamine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H7125-1G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Freezing Media&amp;nbsp;</td><td>Triangle Biomedical Sciences</td><td>TFM-5</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum&amp;nbsp;</td><td>Rockland</td><td>D104-00-0050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>GFAP Antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5804</td><td></td></tr><tr><td>MAP2 Antibody</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>711-095-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>mounting medium containing DAPI</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Laser Confocal Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti microscope</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>1.45s</td><td></td></tr></tbody></table>

an acute retinal model for evaluating blood retinal barrier breach and potential drugs for treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

Wir stellen eine kostengünstige, zeitsparende und einfach zu bedienendes System, mögliche Behandlungen zu bewerten, die gegen die BRB Verletzung durch Histamin induzierte schützen könnte. IgG wird in den Gefäßen in Kontrollnetzhaut (Abbildung 1A) beschränkt, sondern tritt aus der Blutgefäße auf Histamin - Exposition (Abbildung 1B), was bestätigt , dass das Modell erfolgreich etabliert. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1...

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An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Eine kostengünstige, einfach zu bedienende und leistungsfähige System etabliert mögliche Behandlungen zu bewerten, die Blut Retina-Schranke Verletzung durch Histamin induzierte verbessern könnte. Blutgefäße Leckage, Müller-Zell-Aktivierung und die Kontinuität der neuronalen Prozesse werden genutzt, um die Schadensantwort und deren Umkehrung mit einem potenziellen Medikament, Lipoxin A4 zu beurteilen.

Eine akute Retinal Modell zur Bewertung von Blut Retinal Barrier Breach und potenzielle Medikamente für die Behandlung

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

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Serie: An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

Experimentelle Modelle für das Studium der retinalen Pigmentepithelzellen Physiologie und Pathophysiologie

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Forschung

Neurowissenschaften

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Rat Modell der Blut-Hirn-Schranke Störung zu Neurovascular Therapeutics Gezielte zulassen

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Medizin

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Verwendung Adeno-assoziierte Virus als Werkzeug Retinal Barrieren in Disease Study

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Erzeugung von Netzhautdegeneration zur Untersuchung zellulärer Reparaturstrategien bei Xenopus

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair recently emerged as particularly appealing. A cellular source of interest for retinal repair is the M&#252;ller glial cell, which harbors stem cell potential and an extraordinary regenerative capacity in anamniotes. This potential is, however, very limited in mammals. Studying the molecular mechanisms underlying retinal regeneration in animal models with regenerative capabilities should provide insights into how to unlock the latent ability of mammalian M&#252;ller cells to regenerate the retina. This is a key step for the development of therapeutic strategies in regenerative medicine. To this aim, we developed several retinal injury paradigms in Xenopus: a mechanical retinal injury, a transgenic line allowing for nitroreductase-mediated photoreceptor conditional ablation, a retinitis pigmentosa model based on CRISPR/Cas9-mediated rhodopsin knockout, and a cytotoxic model driven by intraocular CoCl2 injections. Highlighting their advantages and disadvantages, we describe here this series of protocols that generate various degenerative conditions and allow the study of retinal regeneration in Xenopus.

Autor im Rampenlicht: Erforschung der Regenerationsmechanismen der Netzhaut beim Xenopus-Frosch 

We have developed several protocols to induce retinal damage or retinal degeneration in Xenopus laevis tadpoles. These models offer the possibility of studying retinal regeneration mechanisms.

Generierung von Netzhautverletzungsmodellen bei Xenopus-Kaulquappen

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...

Entwicklungsbiologie

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, diabetic retinopathy, and retinal vascular occlusions. Rodent models of I/R injury are providing significant insights into mechanisms and treatment strategies for human I/R injury, especially with regard to neurodegenerative damage in the retinal neurovascular unit. Presented here is a protocol for inducing retinal I/R injury in mice through elevation of intraocular pressure (IOP). In this protocol, the ocular anterior chamber is cannulated with a needle, through which flows the drip of an elevated saline reservoir. Using this drip to raise IOP above systolic arterial blood pressure, a practitioner temporarily halts inner retinal blood flow (ischemia). When circulation is reinstated (reperfusion) by removal of the cannula, severe cellular damage ensues, resulting ultimately in retinal neurodegeneration. Recent studies demonstrate inflammation, vascular permeability, and capillary degeneration as additional elements of this model. Compared to alternative retinal I/R methodologies, such as retinal arterial ligation, retinal I/R injury by elevated IOP offers advantages in its&#160;anatomical specificity, experimental tractability, and technical accessibility, presenting itself as a valuable tool for examining neuronal pathogenesis and therapy in the retinal neurovascular unit.

This article describes a procedure for inducing retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure in mice. Retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure serves to model human pathologies characterized by compromised oxygen and nutrient delivery in the retina, enabling researchers to examine potential cellular mechanisms and treatments for human diseases of the retinal neurovascular unit.

Ein Maus-Modell der Netzhautischämie-Reperfusionsschaden Durch Erhöhung des intraokularen Druck

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

Im lebenden Organismus Gefäßverletzungsanzeigen in der Netzhaut der Maus zur Förderung der Reproduzierbarkeit

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal detachment, breakdown of the blood-retinal barrier (BRB), and retinal angiogenesis. An in vivo rat model is a valuable experimental tool to examine the changes in the structure and function of the retina. We propose three different experimental techniques in the rat model to identify morphological changes of retinal cells, retinal vasculature, and compromised BRB. Retinal histology is used to study the morphology of various retinal cells. Also, quantitative measurement is performed by retinal cell count and thickness measurement of different retinal layers. A BRB breakdown assay is used to determine the leakage of extraocular proteins from the plasma to vitreous tissue due to the breakdown of BRB. Fluorescence angiography is used to study angiogenesis and leakage of blood vessels by visualizing retinal vasculature using FITC-dextran dye.

Diabetic retinopathy is one of the leading causes of blindness. Histology, blood-retinal barrier breakdown assay, and fluorescence angiography are valuable techniques to understand the pathophysiology of the retina, which could further enhance the efficient drug screening against diabetic retinopathy.

Retinale pathophysiologische Bewertung in einem Rattenmodell

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and subsequent vision loss. The inner blood-retinal barrier (iBRB) is mainly composed of retinal vascular endothelium with low permeability under physiological conditions. This feature of low permeability is tightly regulated and maintained by low rates of paracellular transport between adjacent retinal microvascular endothelial cells, as well as transcellular transport (transcytosis) through them. The assessment of retinal transcellular barrier permeability may provide fundamental insights into iBRB integrity in health and disease. In this study, we describe an endothelial cell (EC) transcytosis assay, as an in vitro model for evaluating iBRB permeability, using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs). This assay assesses the ability of HRMECs to transport transferrin and horseradish peroxidase (HRP) in receptor- and caveolae-mediated transcellular transport processes, respectively. Fully confluent HRMECs cultured on porous membrane were incubated with fluorescent-tagged transferrin (clathrin-dependent transcytosis) or HRP (caveolae-mediated transcytosis) to measure the levels of transferrin or HRP transferred to the bottom chamber, indicative of transcytosis levels across the EC monolayer. Wnt signaling, a known pathway regulating iBRB, was modulated to demonstrate the caveolae-mediated HRP-based transcytosis assay method. The EC transcytosis assay described here may provide a useful tool for investigating the molecular regulators of EC permeability and iBRB integrity in vascular pathologies and for screening drug delivery systems.

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

This protocol illustrates an in vitro endothelial cell transcytosis assay as a model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability by measuring the ability of human retinal microvascular endothelial cells to transport horseradish peroxidase across cells in caveolae-mediated transcellular transport processes.

Endothelzell-Transzytose-Assay als In-vitro-Modell zur Beurteilung der Permeabilität der inneren Blut-Retina-Barriere

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

Eine akute Retinal Modell zur Bewertung von Blut Retinal Barrier Breach und potenzielle Medikamente für die Behandlung

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Experimentelle Modelle für das Studium der retinalen Pigmentepithelzellen Physiologie und Pathophysiologie

Rat Modell der Blut-Hirn-Schranke Störung zu Neurovascular Therapeutics Gezielte zulassen

Verwendung Adeno-assoziierte Virus als Werkzeug Retinal Barrieren in Disease Study

Generierung von Netzhautverletzungsmodellen bei Xenopus-Kaulquappen

Generierung von Netzhautverletzungsmodellen bei Xenopus-Kaulquappen

Generierung von Netzhautverletzungsmodellen bei Xenopus-Kaulquappen

Ein Maus-Modell der Netzhautischämie-Reperfusionsschaden Durch Erhöhung des intraokularen Druck

Im lebenden Organismus Gefäßverletzungsanzeigen in der Netzhaut der Maus zur Förderung der Reproduzierbarkeit

Retinale pathophysiologische Bewertung in einem Rattenmodell

Endothelzell-Transzytose-Assay als In-vitro-Modell zur Beurteilung der Permeabilität der inneren Blut-Retina-Barriere