Dieses Video zeigt die Herstellung und Anwendung von präzisionsgeschnittenen Leberscheiben als experimentelles Ex-vivo-Modell der Lebergewebebiologie. Präzisionsgeschnittene Leberscheiben besetzen eine experimentelle Nische, die zwischen in vivo Tierstudien und In-vitro-Zellkulturmethoden besteht. Diese Technik hat mehrere wichtige Vorteile gegenüber in vivo Tierstudien, einschließlich der Fähigkeit, Kontroll- und Behandlungsproben aus der gleichen Leber zu verwenden, die Isolierung von Lebergewebe, um Off-Target-Effekte von anderen Organsystemen zu entfernen, und die Fähigkeit, Reagenzien zu verwenden, die eine negative Wirkung haben könnten, wenn sie auf eine ganze lebende Maus angewendet werden, zum Beispiel toxische Signalweginhibitoren.
Die Technik beinhaltet die Verwendung einer seitlich vibrierenden Klinge, um ultradünne Leberscheiben von lebensfähigem Lebergewebe zu schneiden, gefolgt von Laborgewebekultur. Die Vibrationen der Klinge verhindern Risse durch Scherspannung. In diesem Beispiel zeigen wir die Techniken für Präparate lebensfähiger ex vivo Leberscheiben und zeigen die Nützlichkeit der Leberscheibenkultur in Beispielexperimenten, bei denen dieses Ex-vivo-Gewebe mit Gallensäuren behandelt wird, um cholestatische Leberverletzungen zu stimulieren, um die Mechanismen der Leberfibrogenese zu bewerten.
Setzen Sie die Klinge in den Schneidarm ein. Desinfizieren Sie die Klinge und den Schneidarm mit einer 70%-Ethanollösung. Achten Sie immer darauf, den Kontakt mit der Klinge zu vermeiden.
Desinfizieren Sie die Pufferschale mit einer 70%ethanol Lösung und wischen Sie sie mit einem sterilen Gewebe ab. Setzen Sie die Pufferschale in das Vibratome ein und ziehen Sie die Befestigungsschraube fest. Stellen Sie den Schneidarm auf die maximal verfügbare Höhe ein.
Überprüfen Sie den Klingenwinkel. Auf unserem Vibratom verwenden wir einen 10-Grad-Winkel von der Horizontalen, wobei die Klinge in Richtung der Probe abfallt. Stellen Sie sicher, dass der Klingenwinkel fest fixiert ist.
Desinfizieren Sie den Probenhalter erneut mit einer 70%ethanol-Lösung. Schließen Sie das Kühlwasser für den thermoelektrischen Peltier-Kühler unter der Pufferwanne an. Einige Vibratome-Modelle verwenden stattdessen ein Eisbad zum Kühlen.
Befestigen Sie das Wasserrohr an einem Abfluss, und schalten Sie das Wasser ein. Stellen Sie den Kühler auf vier Grad Celsius ein. Eiskalten Krebs-Henseleit-Puffer in die Pufferwanne geben.
Alle chirurgischen Instrumente und Materialien sollten steril sein. Mäuse sollten tief beäschet oder eingeschläfert werden. Die Hautoberflächen an den Mäusen wurden durch Benetzung mit 70%ethanol Lösung desinfiziert.
Machen Sie einen Mittellinienschnitt in die Haut von der Basis der Bauchhöhle bis zum Zwerchfell. Öffnen Sie mit sauberen Zangen und Scheren die Bauchhöhle. Entfernen Sie die Leber schnell, ohne die Lappen zu beschädigen.
Drücken Sie die Leber nach unten, und schneiden Sie das Bindegewebe an der Oberseite der Leber. Drücken Sie die Leber nach oben. Halten Sie den mittleren Gefäßbereich der Leber mit der Zange und ziehen Sie nach oben.
Schneiden Sie Bindegewebs-Blutgefäße. Achten Sie darauf, die Leberlappen nicht zu beschädigen, und achten Sie auch darauf, nicht in den Magen-Darm-Trakt zu schneiden. Die entfernte Leber in eine sterile Schale eiskalten Krebs-Henseleit-Puffer geben.
Trennen Sie die Leber in einzelne Lappen. Wählen Sie einen Leberlappen und legen Sie flache Seite nach unten auf eine neue sterile Schale. Halten Sie andere Lappen auf Eis in Krebs-Henseleit Puffer.
Schneiden Sie die Ränder der Leberlappen. Trimmen ist wichtig, besonders an der Kante, die zuerst mit der Schneidklinge in Berührung kommt, da eine Tissuekante relativ senkrecht zur Schneidklinge eine Gewebekompression verhindert, die in flachen Winkeln auftreten kann. Das Schneiden des Gewebes um die anderen drei Kanten entfernt einen Großteil der faserigen Kapseln am Geweberand und ermöglicht in der Regel eine einfachere Entfernung der Gewebescheiben.
Legen Sie eine dünne Schicht Cyanoacrylatkleber auf die Vorderkante des Probenhalters, etwas größer als die getrimmten Leberlappen. Entfernen Sie alle Pufferrückstände aus dem Gewebe mit sterilem absorbierendem Material. Legen Sie Leberlappen auf Cyanoacrylatkleber, mit der größten Kante nach vorne.
In der Luft ein bis zwei Minuten aushärten lassen. Legen Sie das am Probenhalter befestigte Gewebe in das Vibratome. Stellen Sie die Vibratome-Geschwindigkeit ein.
Senken Sie die Schneidklinge, bis sie sich direkt über dem Leberlappen befindet. Führen Sie den vibrierenden Schneidarm über die Probe. Die Vibration der Klinge an dieser Maschine wird durch das Fußpedal aktiviert.
Geben Sie die Klinge nach hinten zurück, und senken Sie die Klingenhöhe um 250 Mikrometer. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die oberste Gewebeschicht entfernt wird. Entsorgen Sie die ersten ein oder zwei Scheiben, da diese Glissons Kapsel enthalten und daher nicht viel funktionelles Lebergewebe enthalten.
Um Leberscheiben zu schneiden, schieben Sie langsam die vibrierende Klinge in das Gewebe, indem Sie den Griff drehen. Verwenden Sie einen kleinen Pinsel, um das Gewebe während des Schneidvorgangs sanft zu führen. Verwenden Sie den Pinsel, um den geschnittenen Gewebeabschnitt aufzunehmen, und legen Sie den Gewebeteil dann in ein steriles Rohr mit Krebs-Henseleit-Puffer zur Lagerung.
Wenn Sie nicht in Gebrauch sind, halten Sie diese Röhre auf Eis. Einige der Zeit, das Gewebe reißt während des Schneidprozesses, aber für die meisten Zwecke, das Gewebe ist immer noch nutzbar. Schneiden Sie die Gewebescheiben bis in die Nähe des Cyanoacrylatklebers.
Nicht in den Kleber schneiden. Wiederholen Sie dies mit den anderen Leberlappen, die auf Eis sitzen, bis die erforderliche Anzahl von Gewebescheiben erhalten ist. Um den Probenhalter zu reinigen, verwenden Sie entweder eine Klinge, um das Leimgewebegemisch abzukratzen, oder das Gemisch kann mit Lösungsmitteln wie Aceton oder Dimethylsulfoxid erweicht werden.
In einer Gewebekulturhaube, Pipette ein ml von Williams'E Medium enthält 10%fetales Rinderserum und antimikrobielle Mittel in einer 12-Well-Platte. Entfernen Sie die Gewebescheiben, indem Sie die Mischung sanft verwirbeln und in eine sterile Schale kippen. Schneiden Sie das Gewebe in eine ungefähr gleichmäßige Größe.
In diesem Beispiel haben wir uns für Gewebescheiben mit einer Fläche von etwa 50 Millimetern im Quadrat. Achten Sie darauf, die Gewebescheiben auf Konsistenz zu untersuchen. Dunklere Scheiben deuten darauf hin, dass die Gewebedicke erhöht ist und verworfen werden sollte.
Leichtere Scheiben suggerieren das Vorhandensein von gehärtetem Cyanoacrylatkleber und sollten entsorgt werden. Übertragen Sie die Gewebescheiben auf die 12-Well-Platte, die einen Milliliter Medien enthält. Inkubieren Sie die Leberscheiben unter normalen Gewebekulturbedingungen.
Wenn möglich, verwenden Sie Methoden, um die Sauerstoffverfügbarkeit für die Gewebescheiben zu verbessern. Wechseln Sie am Tag danach die Medien mit einer manuellen Pipette, um Denverlust von Gewebe durch Absaugen zu verhindern. Die präzisionsgeschnittenen Leberscheiben sind nun experimentell einsatzbereit.
Für unsere Anwendung haben wir die Leberscheiben zwei Tage lang mit Gallensäuren behandelt und im Lysepuffer für die Boten-RNA-Extraktion und qPCR-Analyse homogenisiert. Um die Lebensfähigkeit von präzisionsgeschnittenen Leberscheiben im Laufe der Zeit zu untersuchen, haben wir ATP-Spiegel als Proxy für die Zelllebensfähigkeit verwendet. Die ATP-Spiegel wurden zu Proteinen normalisiert und an mehreren Zeitpunkten nach der Isolation gemessen.
Die ATP-Werte wurden in den unmittelbaren und einstündigen Proben verringert, diese erholten sich jedoch um drei Stunden. Danach wurden die ATP-Werte fünf Tage lang beibehalten, obwohl sie im Laufe der Zeit rückläufig waren. H&E-Färbung wurde verwendet, um präzisionsgeschnittene Leberscheiben zu untersuchen, die in der Kultur für bis zu fünf Tage gepflegt wurden.
Die Gewebemorphologie deutete auf eine Nekrose hin, die am zweiten Tag auftritt, wobei am fünften Tag eine schwere Nekrose auftritt. Aufgrund der Nekrose, die zwischen den Tagen zwei und fünf passiert, würden wir empfehlen, dass der experimentelle Nutzen dieser Technik auf etwa drei Tage begrenzt ist. Dies könnte jedoch durch die Verwendung besserer Sauerstoffabgabetechniken zu den Gewebescheiben verbessert werden.
Präzisionsgeschnittene Leberscheiben scheinen auch eine Verdickung von Kollagenfasern im Verhältnis zur Zeit in der Kultur zu haben. Dies deutet auf spontane fibrogene Prozesse hin. Im Beispielexperiment wurden die präzisionsgeschnittenen Leberscheiben zwei Tage lang mit drei separaten Gallensäuren behandelt, um die Lebercholestase nachzuahmen.
Betrachtet man die mRNA-Expression von drei cholangioytenspezifischen Genen, die beiden konjugierten Gallensäuren, Glyochkol- und Taurocholic-Säuren, erhöhte die Expression von Cytokeratin-19 und Connexin-43 signifikant. Dies steht im Einklang mit der Cholangiozytenentwicklung. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie präzisionsgeschnittene Leberscheiben erstellen und wie Sie grundlegende Gewebekultur ausführen können.
Präzisionsgeschnittene Leberscheiben können für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, einschließlich experimenteller Untersuchungen in DER RNA-Expression, Proteinexpression, Epigenetik, DNA-Bindung, Stoffwechsel, Infektionsmechanismen, Krebsinvasion, Pharmakologie, Zellbiologie und Sekretionsstudien, um nur einige zu nennen.
