Das Embryonenrettungsprotokoll ist obligatorisch für die Regeneration von unreifen Embryonen, die aus interspezifischen Kreuzungen zwischen verschiedenen Cucurbita-Arten stammen. Es wird am häufigsten für Kreuzungen zwischen Cucurbita moschata und Cucurbita pepo verwendet. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Einfachheit.
Das Protokoll verwendet nur MS-Medien mit Antibiotika. Daher kann es von jedem Labor leicht repliziert werden. Es wäre möglich, diese Technik zu modifizieren, um verschiedene Barrieren für die interspezifische oder intergenerische Hybridisierung zu untersuchen.
Die Aufmerksamkeit auf die Details bei jedem Schritt wird für ein erfolgreiches Ergebnis hilfreich sein. Beginnen Sie mit dem Pflanzen der Cucurbita-Pflanzen, indem Sie 50 Zellstartflächen von 25 mal 50 Zentimetern mit Blumenerde füllen, die mit vollständigem Stickstoff-, Phosphor- und Kaliumdünger ergänzt werden und jeweils 1,38 Gramm pro Kilogramm Stickstoff, Phosphor und Kalium enthalten. Als nächstes säen Sie die Samen auf eine Tiefe, die ihrer Länge entspricht, und bedecken Sie sie mit dem Topfmedium.
Bewässern Sie die Wohnungen, ohne stehendes Wasser zu erzeugen, und halten Sie die Medien feucht, indem Sie sie einmal täglich gießen. Am Ende der zweiten echten Blattstufe verpflanzen Sie die Sämlinge in Töpfe mit einem Durchmesser von 30 Zentimetern, die mit drei Esslöffeln Volldünger pro Topf ergänzt werden. Düngen Sie jeden Topf alle sieben Tage mit 500 Milliliter Flüssigdünger mit 20, 20, 20 Stickstoff, Phosphor und Kalium in einem Gramm, das zu einer Gallone Wasser hinzugefügt wird.
Pflegen Sie die Pflanzen im Gewächshaus bei Temperaturen zwischen 22 und 28 Grad Celsius unter dem natürlichen Lichtregime. Für Vining-Genotypen, stellen Sie ein unterstützendes Spalier im Gewächshaus zur Verfügung. Führen Sie die kontrollierte Hybridisierung oder Bestäubung durch, sobald die Pflanzen sechs bis acht Wochen nach der Aussaat zu blühen beginnen.
Überprüfen Sie die ungeöffneten Blüten mit einem gelben Farbton auf den Blütenblättern und identifizieren Sie männliche Blüten und weibliche Blüten von Cucurbita pepo und Cucurbita moschata Sorten. Um eine versehentliche Insektenbestäubung zu verhindern, kleben Sie die geschlossene Blüte vorsichtig oben mit Abdeckband ab. Führen Sie am nächsten Morgen die Bestäubung vor 10:00 Uhr durch, indem Sie den abgeklebten oberen Teil der männlichen und weiblichen Blüte vorsichtig entfernen.
Trennen Sie die Blütenblätter von der männlichen Blüte und übertragen Sie die Pollen, indem Sie den Staubbeutel sanft an der weiblichen Blütennarbe reiben. Verschließen Sie nach der Bestäubung sofort die bestäubte weibliche Blüte mit Abdeckband und verwenden Sie ein Etikett, um das Datum der Bestäubung aufzuzeichnen und die väterlichen und mütterlichen Eltern anzugeben, die in der Kreuzung verwendet werden. Eine erfolgreiche Kreuzung, die durch einen erweiterten Eierstock angezeigt wird, bildet innerhalb einer Woche eine kleine Frucht.
Ernten Sie die Früchte nach 45 bis 55 Tagen Bestäubung. Bereiten Sie eine Cefotaxim-Brühe vor. Filtern Sie es durch einen sterilen 0,22 Mikron Spritzenfilter.
Und machen Sie 0,5 Milliliter Aliquots von 250 Milligramm pro Milliliter Cefotaxim, bevor Sie sie bei minus 20 Grad Celsius lagern. In ähnlicher Weise bereiten Sie Ampicillin-Vorrat vor. Filtern Sie es durch einen sterilen 0,22-Mikron-Spritzenfilter und bereiten Sie einen Milliliter Aliquots von 100 Milligramm pro Milliliter Ampicillin vor, bevor Sie sie bei minus 20 Grad Celsius lagern.
Bereiten Sie Murashige und Skoog oder MS-Medium vor, indem Sie 2,45 Gramm des Mediums in 500 Milliliter destilliertem Wasser in einer Ein-Liter-Flasche auflösen. Fügen Sie 1,5 Gramm Gellangummi zum MS-Medium hinzu und autoklavieren Sie es bei 121 Grad Celsius für 20 Minuten. Kühlen Sie das Medium ab, indem Sie die Flasche in ein Wasserbad bei 50 Grad Celsius stellen.
Tauen Sie die Antibiotikavorräte im Laminar-Flow-Schrank auf. Die Mediumflasche in die Laminar-Flow-Haube geben und 0,6 Milliliter Cefotaxim-Brühe und 0,25 Milliliter Ampicillin-Brühe bei richtiger Mischung in das Medium geben. Gießen Sie etwa sieben Milliliter des Mediums in eine 60 mal 15 Millimeter sterile Petrischale.
Lassen Sie das Medium in den Petrischalen etwa 15 bis 20 Minuten erstarren. Verschließen Sie die Petrischalen mit Siegelfolie und legen Sie sie bis zur weiteren Verwendung bei Raumtemperatur in eine Aufbewahrungsbox. Ernten Sie die Kürbisfrüchte, indem Sie sie von der Hauptrebe abschneiden, und desinfizieren Sie die Frucht, indem Sie ihre Oberfläche in der Laborspüle mit einem flüssigen Reinigungsmittel wie 0,3% Chloroxylenol waschen.
Spülen Sie die Früchte mit reichlich Leitungswasser ab und trocknen Sie sie mit sauberen Papiertüchern, bevor Sie die Früchte in den Laminat-Luftstromschrank geben. Sterilisieren Sie die Fruchtoberfläche im Schrank, indem Sie 70% Ethanol sprühen. Die Frucht mit einem sterilen Messer halbieren und die Samen extrahieren.
Verwenden Sie sterile Pinzetten oder Hände mit sterilen Handschuhen, um die Samenhülle aseptisch zu öffnen und die unreifen Embryonen freizulegen, bevor Sie sie in eine Petrischale geben, die mit Antibiotika ergänztes MS Medium enthält. Verschließen Sie die Petriplatten mit Wickelfolie und legen Sie sie in eine Wachstumskammer mit 25 Grad Celsius Temperatur, 16 Stunden Fotoperiode und 70% relativer Luftfeuchtigkeit. Im Falle einer Kontamination subkulturieren Sie die nicht kontaminierten Embryonen sofort in eine neue Platte mit dem gleichen Medium.
Sobald sich die Wurzeln nach 10 bis 14 Tagen und die Keimblätter nach 15 bis 21 Tagen entwickelt haben, entfernen Sie die Pflänzchen aus der Petrischalen und waschen Sie die um die Wurzeln vorhandenen Medien vorsichtig mit Leitungswasser ab. Legen Sie gereinigte Pflänzchen in einen 14 x 9 mal 4 Zentimeter großen Kunststoffbehälter und bedecken Sie die Wurzeln mit nassen Papiertüchern. Decken Sie den Behälter ab und befeuchten Sie die Papierhandtücher bei Bedarf.
Halten Sie die Plastikbehälter bei 25 bis 28 Grad Celsius und in einer 16-stündigen Fotoperiode, um die Pflänzchen zu akklimatisieren und gleichzeitig den feuchten Zustand der Papierhandtücher zu erhalten. Nach 7 bis 10 Tagen Akklimatisierung die drei bis vier Zentimeter langen Sämlinge in 50 Zellen mit handelsüblicher Blumenerdemischung mit Dünger umfüllen und ins Gewächshaus bringen. Vermeiden Sie Überwässerung, um Fäulnis zu verhindern, und fügen Sie nach Bedarf etwa 10 bis 20 Milliliter Wasser pro Zelle hinzu.
Im zweiten bis dritten echten Blattstadium verpflanzen Sie die Sämlinge in Töpfe mit 25 Zentimeter Durchmesser, die mit Blumenerde gefüllt sind, die mit Dünger ergänzt wurden, und führen Sie eine kontrollierte Hybridisierung durch, wenn die Pflanzen zu blühen beginnen. Pflegen Sie die Pflanzen im Gewächshaus bei 22 bis 28 Grad Celsius unter natürlichem Licht. Und bewerten Sie die Pflanzen auf Frucht- und Sameneigenschaften.
Vier Cucurbita pepo und 11 Cucurbita moschata wurden für die interspezifische Hybridisierung ausgewählt. Aus 24 versuchten interspezifischen Kreuzkombinationen wurde ein Fruchtsatz für 22 Kreuzungen erhalten, was mehr als 92% Erfolg im Fruchtansatz entspricht. Die Kreuzungen zwischen Cucurbita moschata und Cucurbita pepo mit den Genotypen O und M sowie den Genotypen E und J brachten keine reifen Früchte hervor.
Während die Kreuzung zwischen Cucurbita moschata und Cucurbita pepo mit den Genotypen F und J sechs Früchte hervorbrachte. Die Anzahl der Blüten, die für verschiedene Kreuzkombinationen bestäubt wurden, reichte von 1 bis 11. Und die Erfolgsrate der Bestäubung reichte von 0% bis 100%Von 44 Früchten, die aus allen Kreuzungen produziert wurden, produzierte nur eine Frucht aus einer Kreuzung zwischen Cucurbita moschata und Cucurbita pepo, die Genotypen C und J unreife Embryonen, die gerettet werden konnten.
Für die Entwicklung dieser schlecht entwickelten Embryonen wurden sie mit den Embryonenrettungsmedien kultiviert, was zu einer Erfolgsquote von 80% bei der Embryonenrettung führte. Die beiden wichtigsten Verfahren sind die Identifizierung kompatibler Kreuzungen zwischen zwei Arten, nämlich Cucurbita moschata und Cucurbita pepo, und die erfolgreiche Embryonenregeneration. Da die Embryonenrettungstechnik einfach und leicht replizierbar ist, können Kürbiszüchter weltweit diese Technik zur Rettung unreifer Embryonen verwenden, die aus interspezifischen Kreuzungen zwischen verschiedenen Cucurbita-Arten stammen.
