Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt R01 GM075200 und R01 HL083393 (LAT) unterstützt. Wir erkennen Gemeinschaft Unterstützung für BAF von NIH T90 DA022871 und die Mallinckrodt Institute of Radiology, und VDV aus gewähren 09PRE2060795 von der American Heart Association.

1. Allgemeine Experimentelle Vorbereitung <ol><li> Bereiten Gewebekulturmedium in der Laminar-Flow-Haube. <ol><li> Verdünnen Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (1 L Flasche mit 4,5 g / L Glucose, Natriumbicarbonat und L-Glutamin). Fügen Sie 10 ml Penicillin / Streptomycin / Neomycin Antibiotika. </li><li> Nehmen Sie 100 ml DMEM mit einem sterilen Transferpipette und ersetzen mit 100 ml chick Serum. </li><li> Aliquot der DMEM/10% chick Serum / 1% Antibiotika in sterile 15 ml konischen Röhrchen und frieren. </li></ol></li><li> Bereiten Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit Kalzium und Magnesium ergänzt. Mix 100 ml 10x PBS, 900 mL deionisiertes Wasser und 1 mL einer konzentrierten Calcium-und Magnesium-Lösung (100 mg / mL CaCl 2 • 2H 2 O, 100mg/ml MgCl 2 • 6H 2 O). </li><li> Inkubieren Eier in einer Längsausrichtung auf die gewünschte Stufe durch Hamburger und Hamilton 1 (dh 23-25 ​​Stunden für HH Stufe 5 oder 42 definiert-48 Stunden für HH Stufen 11-12). </li><li> Entfernen Embryonen aus dem Ei mit dem Filterpapier Träger-Methode. <ol><li> Crack the bottom des Eies an der Seite des A150 mm Petrischale. Auseinanderziehen der Schale von unten und entleeren Sie den Inhalt des Eies in die Schüssel. </li><li> Entfernen Sie die dickere, zähflüssige Eiweiß aus dem Ei mit einer stumpfen Zange. </li><li> Cut Kreisen Whatman Nr. 2 Filterpapier 2-3 cm. im Durchmesser. Mit einem einzigen Locher, Löcher in der Mitte des Filterpapiers. Legen Sie eine der Filterpapier Ringe auf das Eigelb in einer Weise, dass der Embryo sichtbar durch das zentrale Loch in den Ring hält. </li><li> Cut um den Außendurchmesser des Filterpapier mit Mikroschere. Entfernen Sie das Papier aus dem Eigelb mit feinen Pinzetten. </li><li> Vorsichtig abspülen den Embryo in PBS, um anhaftende Dotter Partikel zu entfernen. (HH5 Embryonen müssen so lange wie 15-20 Minuten einweichen, um restliche Eigelb zu entfernen). Entfernen Sie das Filterpapier Montage aus dem Bad und legen Sie es Bauchseite in einem35 mm Kulturschale. Platzieren Sie ein zweites Filterpapier Ring auf dem ersten, sandwiching der Embryo zwischen den Ringen. Setzen Sie einen Metallring um die Außenseite des Filterpapiers Sandwich (≈ 1,5 bis 2 cm Durchmesser), um den Embryo zu sichern. </li><li> Tauchen Sie den Embryo in Kulturmedium. Überprüfen Sie richtige Morphologie und embryonalen Stadium mit einer Hellfeld-Mikroskop. </li></ol></li><li> Mit einer Pipette puller zu feinen Spitze Glasnadeln (1,5 mm Innendurchmesser) (World Precision Instruments, Sarasota FL) für nachfolgende Gewebe Dissektionen und Kennzeichnung vorzubereiten. </li></ol> 2. DiI Markierung von HH Stage 5 Embryonen mit Magnetic Eisenpartikel <ol><li> Fügen Sie einige Tropfen der gesättigten DiI in Alkohol, um eine geringe Menge an Eisenpulver (Eisen reduziert, Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) bei Raumtemperatur und trocknen lassen. (Diese Regel bewirkt, dass die Partikel an Kuchen zusammen, sobald der Alkohol verdunstet ist.) Verwenden Sie die Spitze eines gezogen Mikropipette zum Aufbrechen der verklumpten Eisenpartikel,Übertragen auf ein Mikrozentrifugenröhrchen, und spülen Sie sie mehrmals und decken mit VE-Wasser. </li><li> Um label Ektodermzellen in einem HH Stufe 5 Embryo, legen Sie die geernteten Embryo (dh die gesamte Filterpapier Montage) Dorsalseite in einer 35 mm Kulturschale mit einer großzügigen Schicht von Kulturmedien abgedeckt und die Schüssel unter einem Binokular. Verwenden Sie ein Glas Nadel die Dotterhaut zu entfernen und setzen die Ektodermzellen. (Achten Sie darauf, nicht gewaltsam öffnen Embryo.) </li><li> Zeichnen Sie eine Spalte markiert Eisenpartikel (in VE-Wasser) in eine Pasteurpipette. Mit dem Binokular, tauchen die Pipettenspitze unter der Flüssigkeitsoberfläche und Position genau über dem Embryo. Rollende die Pipette langsam hin und her zwischen den Fingerspitzen, drängeln sich die Partikel aus dem pipiette und streuen sie über den Embryo. </li><li> Sobald der Embryo mit Partikeln bedeckt, vorsichtig legen Sie sie in einem 37 ° C Inkubator für etwa 10 Minuten. Nehmen Embryo aus dem Inkubator eind mit einem starken Magneten, um die Partikel zu entfernen. </li><li> Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop mit angeschlossener Videokamera und entsprechende Filter-Einstellungen sowohl Hellfeld-und Fluoreszenz-Bilder des Embryos zu erwerben, wie in Abbildung 2a, b dargestellt </li><li> Beachten Sie das Etikett Dichte. Wenn eine dichtere Verteilung gewünscht ist, verwenden Sie zusätzliche Teilchen (wie oben beschrieben), um den Embryo wieder Etikett und verlängern die Inkubationszeit entsprechend. Wenn die Etiketten zu dicht sind, fügen Sie eine kleine Menge an unmarkiertem Eisenpartikel auf die Mikrozentrifugenröhrchen mit bereits markierten Partikeln gefüllt und Mix der Inhalt des Röhrchens. Wiederholen Sie die Kennzeichnung mit einem neuen Embryo und wieder beachten label Dichte. </li></ol> 3. Polystyrol Microsphere Labeling für Optical Coherence Tomography (OCT) Imaging von HH11-12 Embryonen <ol><li> Bereiten Sie eine Lösung aus schwarz 10 Mikrometer Durchmesser Mikrosphären (Polysciences Inc., Warrington, PA) in PBS in einer 35 mm Petrischale. (Beads sollte groß genug sein, um den Kontrast für die OCT erzeugtBildgebung, aber klein genug, so dass Korngröße in der Größenordnung von einzelnen Zellen ist. Spezifische Werte werden in Abhängigkeit von der Auflösung Ihres OCT-System variieren und das Gewebe untersucht). Ein Tropfen der Stammlösung (2,6% Feststoffe-Latex) pro ml PBS ist in der Regel ausreichend. Ziehen Sie diese Lösung in eine 10cc Spritze mit einer 22-Gauge-Nadel. Vortex die Lösung für 30 Sekunden, um eine gleichmäßige Raupe Verteilung zu gewährleisten. </li><li> Bevel die Spitzen deiner gezogen Glasnadeln mit einer Computer-Festplatte 2. Tipp Durchmesser sollte groß genug sein, dass Perlen können durch die Öffnung passen, aber zur gleichen Zeit, so klein wie möglich, um Gewebe verletzt während der Injektion zu minimieren. </li><li> Füllen Sie eine abgeschrägte Glas Nadel mit dem Bead-Lösung mit der Spritze. Leicht flick der Mikropipette, um sicherzustellen, dass die Lösung die Spitze erreicht. </li><li> Mit einem Mikromanipulator, statt das Glas Nadel im selben Sichtfeld wie der Embryo. Perlen sollten fließt aus der Pipettenspitze. <ol><li> Wenn keine beads Ausfahrt der Mikropipette kann es zu einer Verstopfung sein. In diesem Fall wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,4 mit einem neuen Glas-Nadel. </li><li> Wenn zu viele Perlen Ihr Blickfeld Wolke, kann Ihr Pipettenspitze zu breit sein. Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,4 mit einer neuen Pipette und eine neue Embryo. </li></ol></li><li> Legen Sie die Pipettenspitze in das Lumen des Gehirns Röhre. Achten Sie darauf, nicht zu durchbohren der ventralen Boden des Gewebes. Sie sehen eine vorübergehende Schwellung des Gewebes, wie Perlen und Flüssigkeit geben das Lumen. Dies deutet auf eine erfolgreiche Intubation, jetzt schnell zu entfernen, das Glas Nadel. </li><li> Überprüfen Sie, ob eine ausreichende Dichte Wulst in das innere Lumen des Gehirns Rohr mit einer Hellfeld-Mikroskop. Lassen Sie die Perlen für 20 absetzen - 30 Minuten, bevor Sie fortfahren zu Sect. 4. </li></ol> 4. Data Acquisition * Die folgenden Methoden sind auch für die Fluoreszenz-Markierung oben beschriebene Technik geeignet. Doch mit der Mikrosphären-Kennzeichnung Technik können Wülste lösen bei der Übertragung von Probenzwischen Gründerzentren und Imaging-Systemen. In diesem Fall ist es am besten vorgehen, um 4,2 (das vermeidet Probe Bewegung / Agitation insgesamt) Schritt. Bei beiden Verfahren werden Embryonen gezüchtet, während in flüssigem Kulturmedium eingetaucht. Wenn der Embryo nicht vollständig unter Wasser (wie es der Fall mit einigen konventionellen Zellkultur-Techniken), Gewebe-Geometrie ist stark durch abnorm hohen Oberflächenspannung Lasten und Belastungen Distributionen verändert wird scheitern genau zu erfassen normalen 3-D Morphogenese 3, 4. Darüber hinaus Eintauchen des Gewebes verhindert, dass die hellen Kontrast an der Flüssig-Gas-Grenzfläche während OCT-Bildgebung beobachtet von Verschleierung embryonalen Morphologie und Marker-Koordinaten. <ol><li> Embryo Culture (allgemein) <ol><li> Nach dem Erwerb Ihres ersten Bilder (Hellfeld-, Fluoreszenz-oder OCT), legen bis zu sieben 35 mm Kulturschalen (mit Embryonen) in einem 150 mm Petrischale und legen Sie die gesamte Baugruppe in eine kleine Plastiktüte. Fügen Sie ein paar Tropfen deionisiertes Wasser in den Beutel für die Befeuchtungund füllen Sie den Beutel mit einem 95% O 2 / 5% CO 2-Gemisch. Legen Sie die Embryonen in den Brutschrank bei 37 ° C (Queue Stabiletherm, Asheville, NC) für die gewünschte Zeit bis zum nächsten Bildgebung Zeitpunkt. Mit dieser Methode können Experimente an mehreren Embryonen in den selben Tag durchgeführt werden. </li></ol></li><li> Zeitraffer-Kultur (automatisiert) <ol><li> Zeigen Sie mit der Bezeichnung Embryonen in ein Delta T Dish (35 mm Außendurchmesser, 23 mm zentrale Öffnung mit kegeliger Seitenwand, 0,17 mm dickes Glas; Bioptechs, Butler, PA) mit 1,2 ml Kulturmedium. </li><li> Decken Sie die Schüssel mit einem Glasdeckel bei 37 ° C mit einem Bioptechs Delta T4 Kulturschale Controller (zur Vermeidung von Kondensation). Superfuse der Embryo mit 95% O 2 / 5% CO 2-Gas-Gemisch aus einem Mini-Pump Variable-Flow-Gerät (Fisher Scientific) geliefert. Vor Erreichen des Embryos, Wärme und Befeuchten des Gases durch das Sprudeln es durch VE-Wasser an einem warmen (&lt;100 ° C) heißen Platte. Eine schematische Darstellung dieser experimentellen set-up ist in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Richten Sie die Software automatisch erwerben Bilder mit vom Benutzer festgelegten Zeitintervallen. Für unsere Fluoreszenzmikroskop, verwenden wir Openlab Software (PerkinElmer, Waltham, MA), und für unsere OCT-System verwenden wir gefegt Quelle Thorlabs Software (Newton, NJ). Da diese Methode wird derzeit nur in der Lage Handhabung eines Zeitraffer-Experiment am einer Zeit, ist es oft am besten, damit diese Art von Kulturen über Nacht laufen. Man könnte diese Einschränkung durch die Installation eines automatisierten übersetzbar Bühne kompatibel sowohl mit der Hard-und Software der Imaging-System 5 zu umgehen. </li></ol></li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Die Etiketten werden automatisch (mit Volocity, PerkinElmer) verfolgt oder manuell (mit Hilfe des Handbuchs Tracking-Plugin in ImageJ, NIH) in jedem Experiment. In der Fluoreszenzmarkierung Technik verwenden wir die Matlab-Routine Gridfit 2D-Flächen durch die Marker-Koordinaten, die ermöglicht fit<html> morphogenetic Oberfläche Stämme 6, 7 berechnet werden. Standard-Gleichungen werden verwendet, um diese Werte in eine entsprechende embryonalen Koordinatensystem zu transformieren. Alternativ kann in der OCT-Technik, Oberflächen sind aus segmentierten Bild Bände (erhalten über Standard-Software wie Matlab oder Caret 8) und Stämme generiert in Richtung der maximalen oder minimalen Krümmung der Probe 9 berechnet werden. Wir nutzten unsere Eisenpartikelgehalt Technik zur Kennzeichnung und Verfolgung der Bewegung der ektodermalen Zellen während der Kopf Faltenbildung in den frühen Hühnerembryo. Wie in Abbildung 2a dargestellt wurden fluoreszenzmarkierte Zellen über den gesamten Embryo verteilt. Hellfeld-und Fluoreszenz-Bilder des Embryos wurden in unterschiedlichen Abständen während ex ovo Kultur eingefangen. Die Bewegungen der verfolgten Etiketten (Abb. 2B, C) wurden dann verwendet, um die sich entwickelnde morphogenetische Dehnungsverteilungen während Kopf Faltenbildung (Abb. 2D-F) zu berechnen. t &quot;&gt; Ähnlich unserer Polystyrol-Mikrokügelchen-Technik verwendet wurde, um Gewebe Bewegungen in der Mitte Hinterhirn-Grenze des frühen chick Gehirn zu verfolgen. Wie in Abbildung 3 BD gezeigt, wurden bead Bewegungen für 6 Stunden und Stämme verfolgt Charakterisierung Gewebe Verformung in Längs-und Umfangsrichtung wurden von Marker-Koordinaten berechnet. Beachten Sie, dass diese Methode geeignet für eine deutlich 3-D Verformungen ist wie Perlen auf allen Seiten des inneren Lumen des Gehirns (Abb. 3A) Verkleben neigen. <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Schematische Darstellung des Set-up für Zeitraffer-Gewebekultur. <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Quantifizierung 2-D Gewebe Deformationen in den frühen Hühnerembryo mit verfolgt Fluoreszenzmarker. (A) Merged Hellfeld / Fluoreszenzbild von HH Stufe 5 Embryo nach Entfernung der Eisenpartikel. DiI-Labeled ektodermalen Zellen (rot) sind über den gesamten Embryo verteilt. (B, C) Die Bewegung der markierten Zellen wurde anhand ImageJ. Label Verschiebungen wurden in Embryo-Koordinaten (X, Y) berechnet. Beachten Sie, dass A und B das gleiche Bild sind. (DF) Konturdiagramme der sich entwickelnden Längsdehnung Ausschüttungen während der Kopf Faltenbildung. Longitudinal Lagrange-Stämme wurden in Bezug auf Stufe 5 HH (dh A und B) nach (D) 75 min, (E) 120 min, und (F) 165 min Inkubation berechnet. Diese Stämme zeichnen die Längenänderungen der Linienelemente ursprünglich orientiert entlang der Y-Achse (in der Stufe 5 Embryo). Weitere Einzelheiten zur Verwendung verfolgt label Koordinaten morphogenetic Stämme berechnen kann in Filas et al. (2007) 6 und Varner et al. (2010) 7 gefunden werden. Beachten Sie, dass C-und F das gleiche Bild sind. Maßstab = 500 pm. <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Quantifizierung 3-D Gewebe deformations in den frühen chick Gehirn. (A) Polystyrol-Mikrokügelchen, die die dorsale (schwarzer Pfeil) haften und ventralen (weißer Pfeil) Seiten des Gehirns Röhre sind leicht erkennbar vom umgebenden Gewebe in Quer section.Ventral Ansichten der OCT-Rekonstruktionen zeigen Mikrosphäre Orten in der Nähe der Mitte des Hinterhirn-Grenze bei (B) HH12 und nach (C) 6 h Inkubation (M: Mittelhirn, H: Rautenhirn). Mehrere Gruppen von Perlen sind umrissen, um die gesamte Verformung des Gewebes zu markieren. (D) Longitudinal (E zz) und radiale (E θθ) Lagrange-Stämme wurden aus diesen Verformungen berechnet. Positive und negative Längs-Umfangs-Stämme in der Mitte Hinterhirn-Grenze spiegeln eine axiale Verlängerung und Verkürzung der umlaufenden dieser Region während der Kultur. Weitere Einzelheiten zur Berechnung der morphogenetischen Stämme für komplexe Oberflächen während der Morphogenese in Filas et al. (2008) 9 gefunden werden. Maßstab = 200 um.

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	<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dry+beveling+micropipettes+using+a+computer+hard+drive.">Dry beveling micropipettes using a computer hard drive.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).</li><li>Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+looping+in+experimental+conditions:+the+effects+of+extraembryonic+forces.">Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces.</a> Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).</li><li>Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+as+a+regulator+of+cytoskeletal+contractility+and+nuclear+shape+in+embryonic+epithelia.">Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia.</a> Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).</li><li>Kozel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+fiber+formation:+a+dynamic+view+of+extracellular+matrix+assembly+using+timer+reporters.">Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters.</a> J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).</li><li>Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+as+a+tool+for+measuring+morphogenetic+deformation+of+the+looping+heart.">Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart.</a> Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).</li><li>Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+head+fold+formation:+investigating+tissue-level+forces+during+early+development.">Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development.</a> Development. 137, 3801-3811 (2010).</li><li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+software+suite+for+surface-based+analyses+of+cerebral+cortex.">An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex.</a> J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).</li><li>Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+measuring+deformation+of+folding+surfaces+during+morphogenesis.">A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis.</a> J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).</li><li>Yuan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-registered+optical+coherence+tomography+and+fluorescence+molecular+imaging+for+simultaneous+morphological+and+molecular+imaging.">Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging.</a> Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).</li><li>Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+image-based+method+for+computational+tissue+fate+mapping+during+early+avian+morphogenesis.">A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis.</a> Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).</li><li>Blanchard, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+tectonics:+morphogenetic+strain+rates,+cell+shape+change+and+intercalation.">Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation.</a> Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Zwei Gewebe Kennzeichnung Techniken sind für die ex ovo Kultur der frühen Hühnerembryonen vorgestellt. Die erste nutzt fluoreszierende lipophile Farbstoffe über magnetische Eisenteilchen ausgeliefert, gleichzeitig label Hunderte von Zellen. Allerdings ist diese Methode derzeit nicht kompatibel mit optischen Kohärenztomographie, als Fluoreszenzfarbstoffe in der Regel wenig Kontrast aus den umliegenden Geweben unter Verwendung von 10 Oktober zeigen. Daher zeigen wir eine alternative Technik unter ...

<table border="1"><table border="1"><tbody><tr><td> Material / Reagent </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM - hohe Glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin / Neomycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4083 </td><td></td></tr><tr><td> Huhn Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 16110-082 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos Phosphate Buffered Saline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1408 </td><td> 10X </td></tr><tr><td> Whatman Nr. 2 Filterpapier </td><td> Whatman </td><td> 1002 090 </td><td> 90mm Durchmesser </td></tr><tr><td> Glasmikropipetten </td><td> World PrecisionInstruments (WPI) </td><td> TW150-6 </td><td> 1,5 mm Innendurchmesser </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Invitrogen </td><td> D-282 </td><td></td></tr><tr><td> Eisen reduziert </td><td> Mallinckrodt Baker Inc. </td><td> 5320 </td><td></td></tr><tr><td> 10 pm Durchmesser Microspheres (schwarz) </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 24294 </td><td></td></tr><tr><td> Delta T Dish (für Zeitraffer-Kultur) </td><td> Bioptechs </td><td> 04200415B </td><td> 0,17 mm dick, schwarz </td></tr><tr><td> Delta T4 Culture Dish-Controller </td><td> Bioptechs </td><td> 0420-4-03 </td><td></td></tr><tr><td> Mini-Pump Variable-Flow-Gerät </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tracking morphogenetic tissue deformations in the early chick embryo

Embryonale Epithelien unterziehen komplexe Verformungen (z. B. Biegen, Drehen, Falten und Dehnung) auf die primitive Organe des frühen Embryos bilden. Tracking fiducial Markierungen auf der Oberfläche dieser Hohlkammerplatten ist eine gut etablierte Methode zur Schätzung der morphogenetischen Größen wie Wachstum, Schrumpfung und Scherung. Allerdings sind nicht alle Oberflächen Kennzeichnung Techniken ohne weiteres mit herkömmlichen bildgebenden Verfahren und besitzen unterschiedliche Vor-und Nachteile. Hier beschreiben wir zwei Kennzeichnung Methoden und illustrieren den Nutzen der einzelnen Verfahren. Bei der ersten Methode werden hunderte von fluoreszierenden Markierungen gleichzeitig auf den Embryo mit magnetischen Eisenteilchen angewendet. Diese Etiketten werden dann an Menge 2-D Gewebe Deformationen während der Morphogenese verwendet. In der zweiten Methode werden Polystyrol-Mikrosphären als Kontrastmittel in der nicht-invasiven optischen Kohärenztomographie (OCT) Bildgebung verwendet werden, um 3-D Gewebe Deformationen zu verfolgen. Diese Techniken wurden erfolgreichly in unserem Labor zu physikalischen Mechanismen der frühen Kopffalte, Herz und die Entwicklung des Gehirns studythe umgesetzt und sollte anpassungsfähig sein, um eine breite Palette morphogenetischen Prozessen.

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Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Dieser Artikel beschreibt Oberfläche Kennzeichnung und<em&gt; Ex ovo</em&gt; Gewebekultur in den frühen Hühnerembryo. Techniken zugänglich Zeitraffer-Hellfeld-, Fluoreszenz-und optischen Kohärenz-Tomographie dargestellt werden. Tracking-Oberfläche Etiketten mit hoher örtlicher und zeitlicher Auflösung ermöglicht kinematische Größen wie morphogenetic Stämme (Verformungen) in beiden zwei und drei Dimensionen berechnet werden.

Tracking Morphogenetic Tissue Verformungen in der frühen Hühnerembryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.9K Aufrufe.  Washington University. Dieser Artikel beschreibt Oberfläche Kennzeichnung und Ex ovo Gewebekultur in den frühen Hühnerembryo. Techniken zugänglich Zeitraffer-Hellfeld-, Fluoreszenz-und optischen Kohärenz-Tomographie dargestellt werden. Tracking-Oberfläche Etiketten mit hoher örtlicher und zeitlicher Auflösung ermöglicht kinematische Größen wie morphogenetic Stämme (Verformungen) in beiden zwei und drei Dimensionen berechnet werden.

Serie: Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Assay für Neural Induction im Hühnerembryo

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Elektrophysiologische Aufzeichnung in der Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Gewebeproben

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

Single Cell Transfektion in Hühnerembryonen

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

In ovo Elektroporation in embryonalen Hühnchenretina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Maus embryonalen Entwicklung in einem Serum-freien Whole Embryo Culture-System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...