Diese Arbeit wurde teilweise durch die Finanzierung von RAW aus jeder der folgenden unterstützt: NIH Zuschüsse K01 DK083512, DP2 OD008470 und R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar Zuschussvergabe # 5-FY12-75; Start-up-Fonds von der Universität von Notre Dame College of Science and Department of Biological Sciences. Besonders möchten wir auf Elizabeth und Michael Gallagher zu danken, mit der gesamten Familie Gallagher, der ein großzügiges Geschenk an die Universität von Notre Dame verliehen zur Förderung der Stammzellforschung. Die Geldgeber hatten keine Rolle in dem Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts. Wir danken den Mitarbeiter der Abteilung für Biologische Wissenschaften für ihre Unterstützung, und das Zentrum für Zebrafisch-Forschung an der Notre Dame für ihre herausragende Engagement in der Pflege und das Wohlergehen unserer Zebrafisch-Kolonie. Schließlich danken wir den Mitgliedern unserer Forschungslabor für ihre Kommentare, Diskussionen und Erkenntnisse über diese Arbeit, wiesowie Ringelblume (Maripooka) und Zinnia Wingert natürlich für die Bereitstellung von Schuppen Katzen Schnurrhaare, die meisten ausgezeichnete Peitsche Tools für unsere Forschung.

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Zebrafische haben sich als ein äußerst wertvolles Modellorganismus in der gesamten Forschungsgemeinschaft in den letzten Jahren. Zebrafisch zeigen einen hohen Grad an genetischer Naturschutz mit der höheren Wirbeltieren und Vorteile in Bezug auf ihre Anatomie, Zucht-, und Lebenszyklus machen diese Spezies sehr zugänglich für experimentelle Untersuchungen. Darüber hinaus hat die Weiterentwicklung der molekularen Techniken für den Zebrafisch ferner die Verwendung dieser Modellorganismus in der wissenschaftlichen Forschung gefördert. Zum Beispiel, eine große Vielfalt von transgenen Zebrafischlinien erzeugt worden sind, den Krankheitsverlauf zu untersuchen und viele grundlegende Fragen, die die wichtigsten Mechanismen der Entwicklung zugrunde liegen, einschließlich der Organ beantworten. Demzufolge, basierend auf dem dynamischen Verwendung eines Zebrafischs sowohl Erkrankung und des Entwicklungsforschung, Zellmarkierungsmethoden und Quantifizierung Signal sind ein wichtiger Aspekt der Datenanalyse. Während Methoden, die eine Leuchtstoff beschäftigenAntikörpern verwendet werden, um die Proteinexpression in transgenen Zebrafisch erkennen, Forschern der Regel verlassen sich auf Standard-Verfahren wie WISH 12-16, um die raumzeitliche Lokalisierung von Gen-Transkripte in einer festen, nicht-transgenen Zebrafisch-Probe zu untersuchen. In der Tat ist WISH einer der am weitesten verbreiteten Techniken in der Biologie 16, und ist ein wichtiges Werkzeug, um den Phänotyp von genetischen Mutationen und genetischen Störungen chemische Charakterisierung. Dennoch ist WISH mit einer Reihe von möglichen Gefahren und Herausforderungen verbunden. Um die Spezifität des Antisense-ribroprobe bestätigen, können Sinn Ribosonden als Kontrolle, um die Spezifität des Antisense-RNA-Sonde Färbungsmuster Beurteilung verwendet werden. Während die Abschnitte 4 und 5 sind in der Reihenfolge der Kennzeichnung und Erkennung einer Digoxygenin-markierten Sonde, gefolgt von Fluorescein-markierten Sonde präsentiert, kann diese Reihenfolge umgekehrt werden. Typischerweise werden schwächere Signale (Gene mit niedrigeren Expressionsniveaus) am besten mit Digoxygenin-markierten Sonden und diese Färbung nachgewiesenentwickelt, zuerst mit einem violetten Substrat, gefolgt von der Detektion und Färbung des stärkeren Signals (mehr reichlich exprimierten Gens) unter Verwendung des roten Substrat. Jedoch, wenn zwei Farbreaktionen gehen geführt werden soll, empfiehlt es sich, dass verschiedene Kombinationen von Markierungen und Substrate getestet, um die Verfahren, die am besten für die Datenerfassung und-analyse werden. Darüber hinaus können die Zeiten für das Sperren, Antikörper-Inkubation und Waschen in Abschnitten 4-5 sind Embryonen, die jünger als 24 Stunden nach der Befruchtung zugeschnitten vorgesehen; zeitlichen Abständen dieser gleichen Schritte mit älteren Embryonen zu Salzanreicherung auf der Probe führen. Umfangreiche Tipps zur Fehlerbehebung Standard Zebrafischembryo wollen, haben bereits in der Literatur 12-16 dokumentiert. Wohl die häufigste Dilemma ist Hoch Hintergrund. Wir empfehlen die Erhöhung der Anzahl von MABT Waschungen in Schritt 4,7 bis 15-20 wäscht, wenn nötig, aber nach unserer Erfahrung die Zugabe der Nacht MABT &quot;Super-Wash&quot;gibt hervorragende Ergebnisse, wenn bevor Sie zu Schritt 4.8 in Verbindung mit 10 oder mehr kurze MABT Waschungen verwendet. Ein weiteres Beispiel ist schlecht Dilemma Sonde Infiltration, die mit langen Ribosonden auftreten können. Scheren der Riboprobe folgenden Schritt 3.6 durch alkalische Hydrolyse kann dem entgegenwirken. In unserer Erfahrung mit kleinen Proben wird Scher Sonde in der Regel nicht erforderlich. Allerdings sollte man bedenken, dass wie diese können Faktoren werden im Ergebnis eines Experiments WISH-Parameter zu halten, und wir schlagen vor Prüfung dieser nützlichen Anweisungen zur Fehlerbehebung bereits öffentlich in der Gemeinde bei Bedarf zur Verfügung, um die experimentellen Parameter für WISH in Ihrem eigenen zu verfeinern Forschungs 12. Neben den traditionellen Techniken WISH 12-16, hat es eine kontinuierliche Fortschritte in der Entstehung von WISH Methoden und alternative Protokolle, die formuliert wurden. Dazu gehören neue Möglichkeiten der Signalerfassung, beispielsweise durch die Verwendung von FluoreszenzFluoreszenz 17-19, zu Methoden, die die Lokalisierung von microRNAs 20 zu ermöglichen. Auch so, trotz der vielen Verbesserungen, die Stromzelle Markierungsverfahren hergestellt wurden, die Wirksamkeit dieser Verfahren werden negiert, wenn der Fleck (en) kann nicht einfach in der Probe von Interesse zu einem beliebigen Zeitpunkt dargestellt werden. Diese Einschränkung ist problematisch für die Forscher vor allem, wenn es um die frühen embryonalen Stadien der Ontogenese Zebrafisch betrifft, die möglicherweise zu Lücken führen könnte in unserem Verständnis der verschiedenen Entwicklungsprozesse, die zu diesen Zeiten auftreten. Während des normalen Zebrafisch-Entwicklung, wird der Dottersack schrittweise zu verkleinern, wie die Embryo im Alter von 11. Daher wird bei diesen späteren Entwicklungsstadien (&gt; 24 Stunden nach der Befruchtung) ist WISH Färbung relativ einfach zu analysieren, weil der Embryo ist größer im Vergleich zu den angrenzenden Dottersack. Dies ist jedoch nicht der Fall von Schwanzknospenstadium früh Somitogenese (wenn der embryonalenMasse um das Eigelb positioniert), wobei die opake Dottersack kann manchmal verdecken die Visualisierung der Fleck. Folglich ist die Methode der flachen Montage wurde entwickelt, um die Bild-und Datenanalyseprobleme mit der Charakterisierung der frühen Zebrafischembryo Proben (in Fig. 1 und Fig. 2 schematisch dargestellt) verbunden zu lindern, und ist breit, da die systematischen Phänotypisierung von genetischen Mutationen isoliert verwendet von den ersten großen genetischen Bildschirme 21. Seit dem Aufkommen des flachen Befestigungstechnik hat sich die Analyse der frühen Entwicklungsstadien wurde erheblich verbessert. Sobald das Eigelb aus dem Embryo entfernt wird, ist es möglich, den Embryo flach auf einem Glasträger in der gewünschten Orientierung für die Bildgebung zu legen. Dieses zweidimensionale Position ermöglicht das Betrachten des gesamten Embryos auf einmal, wodurch die Notwendigkeit, die Probe zu drehen verhindert. Zahlreichen Geweben sind in breiten Bereichen des Embryos, wie sichdie Vorläufer, die die Blut-und Nieren bilden. Weiterhin kann man brauchen, um mehrere verschiedene Gewebe entwickeln auf einmal vergleichen. Flache Montage ermöglicht die Forscher gleichzeitig betrachten die gesamte Domäne solcher Zellgruppen, und kann somit große Hilfe Quantifizierungen wie einem Flächenmessung für ein Gewebe-oder Zellzahlen. Diese Technik hat sich letztlich dazu beigetragen, führte zu vielen Entdeckungen über eine Vielzahl von wichtigen Entwicklungsmechanismen Hämatopoese, Neurogenese und Organogenese zugrunde liegen. So, einmal gemeistert, die Anwendungen für diese einfache Technik für die Forscher sind ganz erheblich. Zum Beispiel, in einer Studie, Abstammung Wahl während der Hämatopoese, flach montieren Zubereitungen von Zebrafischembryonen bei den 14 und 18 Somiten Stufen (ss) wurden verwendet, um die Änderungen, die in der Expressionsmuster des PU.1 Zinkfinger-Transkriptionsfaktor zwischen aufgetreten veranschaulichen Wildtyp-und GATA1 Morpholino injizierten Embryonen 22.Dieses Verfahren ermöglichte die Detektion eines erweiterten PU.1-Domäne bei 18 ss, die anzeigt, dass GATA1 ist wahrscheinlich die Expression von PU.1 in der Zwischenzellmasse (ICM) um diesen Zeitpunkt. Zusätzliche flach montiert Embryonen für verschiedene erythroid Gene einschließlich gtpbp1 und Epsin gefärbt zeigte einen Verlust in der Expression dieser Gene in vlt Mutanten, die GATA1 waren - / -. Weitere Analysen zeigten keine Veränderung in der Expression von Genen wie erythoid biklf und testhymin, die bekannt waren, unabhängig von gata Aktivität sein. Daher wird in Verbindung mit ihren anderen experimentellen Ergebnissen wurde gezeigt, dass GATA1 wesentlich bei der Regulierung der Differenzierung von Zellen in der erythroiden Abstammungslinie Myelom. In einer Studie der Neuralleiste Entwicklung wurden flache Halterungen verwendet werden, um Crestin Ausdruck in mont blanc untersuchen (mob m610)-Mutanten in einer StudieUntersuchung der Rolle von Mont Blanc und tfap2a Genfunktion 23. Bei 10 und 20 ss, wurde Crestin Ausdruck ganz in den Kopf aufgehoben und wurde im Rumpfbereich der Mob m610-Mutanten im Vergleich zu den normalen Wildtyp-Ausdruck zurück, schließlich Unterstützung bei dieser Gruppe, über die Bedeutung des Mont Blanc und tfap2a Regulierung schließen während Neuralleisteninduktion. Zusätzlich wird in Bezug auf Organ, Flachlager haben die Entdeckung der Anwesenheit von verschiedenen Domänen in den frühen Nierenvorläuferfeld während der Entwicklung des Zebrafisch embryonalen Niere, wie die Pronephros bekannt freigegeben. Die Zebrafischembryo bietet eine konservierte und doch anatomisch einfaches System zu untersuchen, wie Nierenvorläuferzellen führen zu den nephron Funktionseinheiten, die die Pronephros umfassen, ein Verfahren, wie bekannt Nephrogenese 6,7 (Abbildung 4). Wohnung montieren Analyse hat sich als nützlich erwiesen, um Dokument-Domänen der Wiedernal-und Vorläuferzellen, um das Ergebnis von Veränderungen in RA-Signalisierung während Pronephros Strukturieren 6,7 (Abbildung 5), die bisher unbekannt war sezieren. Zusammengenommen deuten diese Beispiele, dass es tatsächlich viele breite Anwendungen für diese Wohnung montieren Protokoll in der Studie der vielfältigen Prozesse, die während der normalen Entwicklung und Krankheitszuständen auftreten. Konzeptionell ist diese flache Halterung Verfahren recht einfach insgesamt. Allerdings können die Manipulationen und der Grad der Finesse erforderlich, um dieses Verfahren beherrschen recht schwer zu meistern in der Abwesenheit von visuellen Demonstration sein. Daher wurde dieses Protokoll erstellt, um Forscher, vor allem diejenigen, die mit dem Zebrafisch-Modell, mit der Möglichkeit, besser zu verstehen, wie diese Technik durchführen und unsere Beratung zu den Reagenzien, Gewebe Handhabung optimieren können. Wir hoffen, dass dieses Protokoll wird letztlich anderen in der Gemeinschaft, die ideale Probenbedingungen zu verfeinern, um used für Premium-Bildgebung, Datenanalyse und Kommunikation der Ergebnisse in Publikationen. Letztlich sollte dies Forschern ermöglichen, die anatomischen Hindernisse des Zebrafisch während der frühen Embryogenese zu überwinden, welche die Darstellung der Versuchsergebnisse verschleiern kann, und lösen diese durch die Verwendung dieser einfachen, aber bedeutende Technik.

Der Zebrafisch, Danio rerio, hat sich ein weit verbreiteter Organismus in der Studie der Entwicklungsbiologie. Zebrafische sind eine tropische, Süßwasser-Wirbeltierarten aus der Familie der Karpfenfische gehören. Zebrafisch wurden ursprünglich für Umweltforschung verwendet, um Informationen über die Gefahren von möglichen Wasserschadstoffe zu gewinnen, da sie leicht zugänglich, kostengünstig und einfach zu behalten 1 waren. In den letzten dreißig Jahren hat der Zebrafisch werden als genetisch manipulierbaren Wirbeltier-Modellsystem für eine Vielzahl von Gründen anerkannt. Zebrafisch zeigen eine hohe anatomische und physiologische Erhaltung mit höheren Wirbeltieren einschließlich Säugetieren 2,3. Jüngsten Genoms Annotation hat ergeben, daß etwa 70% aller menschlichen Gene mindestens eine Zebrafisch-Gegenstück 4. Zum Beispiel haben viele orthologen Gene, die eine wichtige Rolle während der Nierenentwicklung spielen zwischen diesen Arten 5-7 identifiziert worden. Diese dramatic Konservierungsgrad in Bezug auf Zell-und Molekularbiologie konnten die Forscher Modelle für eine Vielzahl von Krankheiten des Menschen in der Zebrafisch-8 erstellen und Zebrafisch haben ein wertvolles Werkzeug, um potenzielle medikamentöse Therapien identifizieren, mit chemisch-genetischen Screens 9 geworden. Darüber hinaus ist der Zebrafisch-Modell nicht nur in der Lage, eine Vielzahl von komplexen Entwicklungsprozesse und Krankheitszustände, die in den Menschen gesehen werden rekapitulieren, sondern mehrere zusätzliche Attribute seine Attraktivität erhöhen auch als Modellorganismus für embryologische Studien. Zebrafische sind eierlegend und reproduzieren durch Broadcast Laich, die die Forscher mit einfachem Zugang zu den Embryonen vom Beginn der Befruchtung 10 liefert. Weitere Vorteile sind Embryo Größe, Transparenz und eine schnelle, externe Entwicklungs 10. Zusätzlich Zebrafisch Erwachsenen besitzen eine hohe Fruchtbarkeit und erzeugen typischerweise relativ großen Kupplungsgrößen, die zwischen 200 bis 500 liegen kannpro Woche, so dass die Forscher schließlich Hochdurchsatz-Experimenten, wie Phänotyp Chemie Bildschirme, mit Leichtigkeit 9 durchzuführen. Auch so, trotz der Fülle von Vorteilen, die durch die Zebrafisch-Modell gezeigt werden, gibt es Probleme, die mit der Analyse und Kommunikation der von der frühen Entwicklungsstadien erhaltenen Versuchsergebnisse beziehen. In einigen Fällen könnte die inhärente Anatomie des Zebrafischembryos der Visualisierung von Daten von einem zu verschleiern. Nach der Befruchtung der Ausgangszelle durchläuft mehrere Spaltungsereignisse wie die Entwicklung fortschreitet 11. Nach Gastrulation tritt der embryonalen Achse an der Schwanzknospen-Stufe (10 HPF), so daß es um das Eigelb 11 gewickelt. Als weitere Entwicklung schreitet durch die Segmentierung Zeitraum wird der Stamm in der Masse zu wachsen und auch verlängern durch axiale Dehnung, so dass ein Schwanz zusammen mit einem Teil des Dottersacks selbst erstrecken sich von der zentralen Dottermasse11. Zwischen der Schwanzknospe und 20 Somitenstadium (19 hpf), versucht, spezifische Entwicklungsmerkmale nach der Nutzung der verschiedenen Färbemethoden wie WISH zu beobachten, kann eine Herausforderung sein, sowohl aufgrund der Geometrie des Embryos und Deckkraft zu visualisieren und zu fotografieren der Dottersack. Eine Möglichkeit, diese Probleme zu beseitigen, ist das Eigelb zu entfernen, und dann abzuflachen des Embryos in einem zweidimensionalen Probe, die in einer einfacheren Weise analysiert werden kann. Die folgenden Protokoll-und Video-Ressourcen bieten eine Anleitung, wie Sie erfolgreich deyolk und Flachmontage einen Embryo nach Fixierung und Färbung, am Beispiel von ein oder zwei-Farben-WISH Färbung. WISH ist eine weit verbreitete Technik, die den Nachweis von spezifischen Nukleinsäuren in Präparate ermöglicht und somit erlaubt die Stelle (n) der Genexpression in Geweben festgestellt werden. WISH Techniken sind ausführlich beschrieben und können mit verschiedenen Farbuntergründe sowie geführt werden Grippeorescent Detektionssysteme 12-20. Hier bieten wir unseren für Zebrafischembryonen zwischen den Schwanzknospe und Segmentierung Entwicklungsstadien verwendet modifizierte WISH-Protokoll. Alternative WISH-Protokolle sind jedoch mit der flachen hier beschriebene Montageverfahren kompatibel ist, wie eingangs der unten Protokoll vermerkt. Zusätzlich könnte flache Montage in Verbindung mit einer beliebigen Anzahl von bestehenden Visualisierungstechniken wie whole mount Immunhistochemie oder Zelllinie Spurmarkierungen sind, die in diesem Protokoll beschrieben sind, verwendet werden. Insgesamt kann die Technik der flachen Montage besser ermöglichen eine optimale Analyse und Präsentation von Daten aus Versuchen mit den frühesten Stadien der embryonalen Entwicklung im Zebrafisch erhalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:163px;">50 X E3</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">1 X E3</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Dilute 50 X E3 in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">mesh tea strainer</td>
			<td style="width:96px;">English Tea Store</td>
			<td style="width:119px;">SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">embryo incubation dish</td>
			<td style="width:96px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">35-1005</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">transfer pipet</td>
			<td style="width:96px;">Samco</td>
			<td style="width:119px;">202, 204</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">flat-bottom microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:96px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">87003-300; 87003-298</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glass vial</td>
			<td style="width:96px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">225012</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">1 X Pbst</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs, made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Tween-20 stock</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">10X Pbs&#160;</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB11072</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:96px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">19210</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Dissolve 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 &#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">filter sterilization unit</td>
			<td style="width:96px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430516</td>
			<td style="width:383px;">1L filter system, 0.45 um CA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">MeOH</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">34860-4L</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">proteinase K</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">03-115-879-001</td>
			<td style="width:383px;">Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/mL) and store aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">HYB+</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 ug/ul heparin</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11175025910; 11685619910</td>
			<td style="width:383px;">Refer to manufacturer instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">SP6 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11487671001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10881775001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">T3 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11031171001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">RNase 1 inhibitor</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3335399001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycogen</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10901393001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td style="width:383px;">Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">molecular grade distilled water</td>
			<td style="width:96px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">25-055-CM</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">waterbath</td>
			<td style="width:96px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">51221073</td>
			<td style="width:383px;">Model 2831</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">nanodrop</td>
			<td style="width:96px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000c</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;"></td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">formamide</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00600</td>
			<td style="width:383px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">20X SSC</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB13156</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">MAB</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">2L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 mLs of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">MABT</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">MAB + 0.1% Tween-20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:163px;">block solution</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">We make in 50 ml fresh aliquots: 10 mLs of BSA (from 10% lab stock), 5 mls of FCS (from stock), and 35 mLs of MABT. Save unused block at 4 &#176;C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 &#176;C&#8212;if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">FCS (fetal calf serum) stock</td>
			<td style="width:96px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16140089</td>
			<td style="width:383px;">Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">BSA (bovine serum albumin) stock</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00448</td>
			<td style="width:383px;">Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 &#176;C. Store undissolved BSA flakes at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">anti-digoxigenin antibody</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11-093-274-910</td>
			<td style="width:383px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">anti-fluorescein antibody</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11-426-338-910</td>
			<td style="width:383px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">12-well staining dish</td>
			<td style="width:96px;">BD-Falcon</td>
			<td style="width:119px;">35-3225</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">pre-staining&#160; buffer</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">staining solution-purple</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">For every 10mLs needed: add 45 uL of NBT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">staining solution-red</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">For every 10mLs needed: add 31.5 uL of INT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples)..</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">NBT stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6876</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 50mg/mL in 70% DMF, 30% water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">INT stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I8377</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 55mg/mL in 70% DMF, 35% water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">BCIP stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B8503</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 50mg/mL in 100% DMF.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">DMF (dimethylformaldehyde)</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00450</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycine</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8898</td>
			<td style="width:383px;">&#160;0.1 M glycine, pH 2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">small plastic Petri dish</td>
			<td style="width:96px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430589, 430588</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycerol</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7893</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">fine forceps</td>
			<td style="width:96px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:383px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:163px;">lash tool</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Constructed by affixing a suitable lash to a pipet tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipet tip). The pipet tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g. Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">glass slide</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:383px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">glass coverslip</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:383px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">modeling clay</td>
			<td style="width:96px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:383px;">Other craft modeling clay products can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">slide holder</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587-10</td>
			<td style="width:383px;">Cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:96px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645, SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">compound microscope</td>
			<td style="width:96px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">80i, 90i</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization

Die Zebrafischembryo ist jetzt allgemein für die Grundlagenforschung und biomedizinische Forschung verwendet, um die genetische Kontrolle der Entwicklungsprozesse zu untersuchen und zu angeborenen Missbildungen zu modellieren. Am ersten Tag des Lebens, schreitet die Zebrafisch-Embryos durch viele Entwicklungsstadien einschließlich Düngung, Spaltung Gastrulation, Segmentierung und der Organogenese von Strukturen, wie den Nieren, Herz und Zentralnervensystem. Die Anatomie eines jungen Zebrafischembryos zeigt mehrere Herausforderungen für die Visualisierung und Analyse der in vielen dieser Ereignisse beteiligt, da das Gewebe Embryo in Verbindung mit einem Runddottermasse. So ist eine genaue Analyse und Abbildung von experimentellen Phänotypen in festen embryonalen Proben zwischen der Schwanzknospe und 20 Somitenstufe (10 und 19 Stunden nach der Befruchtung (hpf), respectively), wie sie gefärbt mit ganzen mount in situ Hybridisierung (WISH), es Oft ist es wünschenswert, den Embryo aus dem Eigelb zu entfernen balle und zu positionieren, flach auf einem Glasträger. Allerdings Durchführung einer flachen Montageverfahren kann sehr mühsam sein. Daher erfolgreiche und effiziente Flachmontage Vorbereitung ist stark durch die visuelle Demonstration der Präparationstechnik erleichtert und auch mit Reagenzien, die in der optimalen Handhabung Gewebe unterstützen geholfen. Hier bieten wir unseren WISH-Protokoll für ein-oder zweiFarbErkennung der Genexpression im Zebrafischembryo, und zeigen, wie die flache Montageverfahren kann auf diesem Beispiel eines gefärbten fixierten Probe durchgeführt werden. Diese flachen Montage Protokoll ist breit anwendbar auf die Untersuchung von vielen embryonalen Strukturen, die während der frühen Zebrafischentwicklung entstehen, und kann in Verbindung mit anderen Färbemethoden auf fest Embryo Proben durchgeführt umgesetzt werden.

Das flache Befestigungs Protokoll Verfahren beinhaltet Transformation des Zebrafischembryos aus seiner normalen Anatomie, wobei der Körperachse um einen zentral gelegenen Dotterkugel gewickelt, in einer zweidimensionalen Zubereitung (Fig. 1A). Whole mount Abbildung des jungen Zebrafischembryos durch die Art, wie der embryonalen Achse um den Dotter gewickelt beschränkt. Als Ergebnis, Seiten-oder Rückenansichten von ganzen montieren Bunt Embryo Proben können nur einen Teil der Achse oder obskuren bestimmten Geweben (Abbildung 1B) zu erfassen. Im Vergleich deyolking und Abflachung des Embryos kann die gesamte embryonalen Achse, die gleichzeitig (Fig. 1B) dargestellt werden. Diese Einschränkungen werden durch die Untersuchung einer WISH gefärbten Embryos, die mit Antisense-Ribosonden markiert war zu erkennen irx3b (lila), die eine Untergruppe der Nierenvorläuferzellen befinden, durch 13 neben Somiten 7 markiert und MyoD1 (rot), die Etiketten zeigte dieSomiten (Abbildung 1B). Der Bereich der irx3b + Nieren Vorläufern in dem gesamten verdeckt montieren Seitenansicht weil irx3b Transkripte sind reichlich vorhanden in dem Zentralnervensystem, so dass die Nieren Feld praktisch unmöglich, mit der seitlichen Kamerawinkel zu visualisieren; Ferner ist der Bereich der irx3b + Nieren Vorläufer nur teilweise sichtbar ist, wenn der Embryo wird in eine dorsale Ansicht der Kamera gedreht, da der Bereich um den Dotter (1B) gewickelt. , Eine Rückenansicht des gleichen Embryos folgenden flachen Montage ermöglicht es jedoch, den gesamten Bereich der irx3b + Nierenvorläuferzellen, um auf einfache Art und Weise in Bezug auf die Somiten entlang des Rumpfes und anderen embryonalen Strukturen (Abbildung 1B) analysiert werden. So können aufwendige Raum Domains idealerweise mit diesem Verfahren dokumentiert werden. Mehrere große Schritte bei der erfolgreichen Durchführung der flachen Halterung Verfahren beteiligt. Um diese durchführen technique, muss das Eigelb Ball als Erster aus dem Embryo richtige (2A), die mit feinen Instrumenten wie einer feinen Pinzette getan werden kann, während der Embryo mit einem Stereomikroskop sichtbar gemacht werden gelöst werden. Nach der Entfernung des rohen Eigelb Ball wird eine feine Wimpern Werkzeug genutzt, um abkratzen Dotterkörnchen, die der Embryo (2B) befestigt geblieben. Die Entfernung der Restdotterkörnchen hilft, Visualisierung der embryonalen Geweben zu erleichtern. Schließlich wird der Embryo deyolked manipuliert, um es stabil auf einem Glasobjektträger (2C), die Beobachtung und Hilfsmittel Dokumentation der Probe mit Bildverarbeitungssoftware und eine Kamera an das Mikroskop angeschlossen ermöglicht positionieren. Die Peitsche Werkzeuge sind hausgemacht Geräte, die durch das Anbringen eines geeigneten Peitsche mit einer Pipettenspitze mit Sekundenkleber konstruiert werden können, die auf einem Handgriff, wenn gewünscht (3A, Materialien Tabelle) montiert werden kann. Verschiedene Peitsche Proben beschafft zu erzeugenpeitschen Werkzeuge mit leicht unterschiedlichen Eigenschaften in Bezug auf Länge und Verjüngung (3B), die die einzelnen Benutzer unterschiedliche Vorlieben für sobald sie mit der flachen Montageverfahren zu experimentieren beginnen haben. Beispiele für Wimpern Proben umfassen natürlich Schuppen menschlichen Wimpern, natürlich Schuppen Tier drahtige Haar-oder Barthaare und schließlich synthetischen Sorten von kommerziell erhältlichen Wimpern im Einzelhandel Kosmetik-Abteilungen gefunden. Die lokale Umgebung und die Probe (n) auf einem Glasträger (4A) angeordnet enthält, kann für die hochauflösende Analyse abgebildet werden. Eine Kombination von Sonden wurden verwendet, um die Entwicklung von Nierenvorläuferzellen, die Anlass zu der Niere in der Wildtyp-Embryo im frühen Entwicklungsstadien mit zweifarbigen WISH beschriften und dann flach montieren Vorbereitungen wurden durchgeführt, um die Proben (4B, 4C ansehen ). Während der frühen Stadien Somiten sind Nierenvorläuferzellen in einem U-förmigen Muster von th abgegrenzteir Ausdruck pax2a Transkripte (lila), die die paraxiale Mesoderm, die gleichzeitig drückt Delta C (dlc) (rot) (linke Spalte, 4B) 6,7. Im Vergleich dazu, wenn DLC-Transkripte wurden mit einem violetten Substrats nachgewiesen und wurden in Kombination mit dem Hinterhirn Marker Krox20 (rot) markiert, ein rostralen Subdomäne des Nieren Vorläufer wurde sichtbar gemacht, die DLC (rechte Spalte, 4B) exprimiert, wie zuvor angemerkt 6,7. Wohnung montieren Zubereitungen können ähnlich verwendet werden, um später Somitogenese Stufen zu untersuchen. Am 14 Somitenstadium, analysierten wir die Expression von Marker der Nieren pax2a, slc4a4 und SLC12A3 (lila) zusammen mit smyhc1 (rot), die die Somiten (4C) markiert. Diese Kombinationen ermöglichen die Abbildung des gesamten Nierenvorläuferdomäne mit pax2a, während offenbart, dass eine Teilmenge der Zellen in einer rostralen Subdomäne exprEssed slc4a4a und wurden von einem nicht-überlappenden Schwanzdomäne der Nierenvorläuferzellen, die SLC12A3 ausgedrückt aus. Zwei-Farben-WISH und die flache Montage Vorbereitung sind auch wertvoll für die Untersuchung der zellulären Domänen während der Organogenese im Zebrafisch mit genetischen Mutationen oder andere Störungen aus der Umwelt gegenüber kleinen Molekülen 6,7 (Abbildung 5). Die Zebrafisch-Mutanten nls und lib Hafen Mutationen in Aldehyd-Dehydrogenase 1a2 (aldh1a2, früher als raldh2 bekannt), die ein Enzym für die Biosynthese von Retinsäure (RA) erforderlich kodiert. RA ist wichtig für die richtige Entwicklung der Nieren vielen Zelltypen, einschließlich der Bildung von Zellen, die Podozyten, um den Blutfilter der embryonalen Niere, als Glomerulus 6,7 bekannt zu machen beitragen. WISH wurde durchgeführt, um die Vorläuferzellen mit Podozyten wt1a gleichzeitig mit Abgrenzung von T beschriftenentwickelt er Somiten mit smyhc1 und Hinterhirn mit Krox20 in Wildtyp-Embryonen, nls mutierten Embryonen lib mutierten Embryonen und Embryonen mit einem Enzym ALDH chemischer Inhibitor, DEAB (Abbildung 5) behandelt. Embryonen mit mangel aldh1a2 Ausdruck zeigte reduziert wt1a Expression im Vergleich zu Wildtyp-Embryonen, während DEAB-behandelten Embryonen zeigten eine Aufhebung der wt1a Transkripte (Abbildung 5, rechte Spalte). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, wie repräsentativ die flache Halterung Technik kann verwendet werden, um zu analysieren und zu dokumentieren anatomischen Unterschiede mit Präzision im frühen Embryo und damit für wertvolle Entwicklungsstudien implementiert werden kann. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1.jpg" /> Abbildung 1. Übersicht der flachen Halterung VorbereitungRation für Zebrafisch-Embryonen. A) Das Verfahren des flachen Montage ermöglicht die gleichzeitige Ansicht von Geweben entlang der embryonalen Achse, weil die zentrale Dottermasse wird entfernt und auf einer flachen Oberfläche der Embryo stabil positioniert. B) Bilder einer ganzen montieren wollen Bunt Embryo in Quer-und Rückenansichten und dann nach einer flachen Montagevorbereitung wurde durchgeführt. Der Embryo wurde mit Antisense-Sonden gefärbt, um Gen-Transkripte irx3b (lila) und MyoD1 (rot) kodiert, zu erkennen. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung des flachen Montageverfahren für Zebrafisch-Embryonen. A) Der Embryo wird zunächst grob deyolked, um die Mehrheit der Dottermasse zu entfernen, dann (B) die ventrale Oberfläche fein deyolked restlichen Dotterkörnchen zu entfernen, undNach dem Waschen der Embryos (C) montiert Rückenseite nach oben auf einem Glasobjektträger für die visuelle Analyse und / oder fotografische Bildgebung. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3.jpg" /> Abbildung 3. Fotografien von beispielsweise Wimpern Tools im Vergleich zu feinen Pinzette. A) Peitsche Hausgemachte Werkzeuge wurden neben einer Standard-feinen Pinzette abgebildet, neben einem Lineal, um eine Referenz. B) Vergrößerte Ansicht der Peitsche Werkzeuge neben den feinen Pinzette Verfügung zu stellen, mit dem Referenz Millimeter entlang der oben in der Ansicht bereitgestellt positioniert . Zwei verschiedene Wimpern Werkzeuge angezeigt, mit dem Stern (*) verwendet, um die von Wimpern markieren erhalten ein natürlich Schuppen menschlichen Wimper, und zwei Sternchen (**) verwendet, um eine Peitsche, die aus einer natürlich Schuppen Katzen-Whisker erhalten und getrimmt wurde markiert machen einen etwas stumpfen Ende. In jedem ca.se, die Peitsche wurde durch die Pipettenspitze eingefädelt und mit mehreren Schichten von Sekundenkleber befestigt, um eine starke Dichtung zu stabilisieren / verankern, die Peitsche in die Pipette in ein Handhabungsgerät angebracht zunehmend zu schaffen. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4.jpg" /> Abbildung 4. Charakterisierung der entwicklungsbedingten Veränderungen in der Nierenvorläufer Feld in der Wildtyp-Zebrafisch-Embryos. A) Bewegen schema, der den Bereich für die Analyse in (B, C). B) Wildtyp-Embryonen in der 1, 3 und 5 Somitenstufe wurden durch Zweifarben-WISH gefärbt, um die Zusammensetzung der Nierenvorläuferfeld, gibt beurteilen abzubildenden steigen, um die embryonale Niere oder Pronephros. (Linke Spalte) Transcripts den Transkriptionsfaktor pax2a (in lila gefärbt) kodiert markieren mehrere Populationen im Embryo, einschließlich der Nieren progenitor Feld, das von der Zwischen Mesoderm entsteht. Abschriften der Notch-Liganden dlc Codierung markieren die Somiten, die aus dem paraxialen Mesoderm (rot angefärbt) bilden. (Rechte Spalte) Wenn der Ausdruck der dlc-Transkripte (in lila gefärbt) und dem Hinterhirn Rhombomer Krox20 Marker (rot gefärbt) werden in den gleichen Embryonen untersucht, kann dlc Ausdruck in einer Subdomain rostral der Nierenvorläuferzellen befindet sich neben Somiten beobachtet werden 1-5, die bei der Co-Färbung der dlc mit pax2a. C) Wildtyp-Embryonen im 14 Somitenstadium verdeckt wurde, waren doppelt oder mit einer Kombination aus einem Nierenmarker (lila Dreifach-gefärbt), die Somiten smyhc1 Marker (rot) und das Hinterhirn Rhombomer Marker Krox20 (auch rot). (Top-Panel) In diesem Stadium pax2a Transkripte weiterhin die Nierenvorläuferzellen abzugrenzen. (Middle, Nieder Platten) Im Nierenvorläufer Gebiet, ein rostralen Subdomain ist markiertvon slc4a4 und Abschriften, die SLC12A3 kodieren markieren eine Schwanzdomäne. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5.jpg" /> Abbildung 5. Die Verwendung von Flach montiert Vorbereitungen, um die Phänotypen durch genetische Mutationen oder chemisch-genetischen Störungen, die Retinsäure Biosynthese modulieren verursacht charakterisieren. WISH Die Expressionsmuster bei den 15 Somitenstadium wt1a (lila) und smyhc1/krox20 (rot) wurde im Vergleich zwischen Wildtypen und Embryonen mit Defiziten in der Retinsäure (RA) Produktion aufgrund von Mängeln in Aldehyd-Dehydrogenase 1a2 (nls und lib-Mutationen) oder chemische Hemmung der Retinaldehyd-Dehydrogenase-Aktivität mit Diethylaminobenzaldehyd (DEAB). Die Reduktion der RA-Produktion in lib ist etwas schwerer als nls, wielib, dass Embryonen zum Ausdruck leicht reduziert Färbung von wt1a Transkripte als ähnlich inszeniert nls mutierten Embryonen, während DEAB Behandlung von Wildtypen ist mit einer kompletten Aufhebung der wt1a Expression assoziiert.

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Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

Die Zebrafischembryo ist ein hervorragendes Modell für Entwicklungsbiologie Forschung. Während der Embryogenese entwickeln Zebrafisch mit einem Dottermasse, die dreidimensionale Herausforderungen für die Proben Beobachtung und Analyse präsentiert. Dieses Protokoll beschreibt, wie man zweidimensionale Flachmontage Zubereitungen der ganze Berg in situ (WISH) gefärbt Zebrafischembryo Proben erstellen.

Wohnung Berge Vorbereitung für Beobachtung und Analyse der Zebrafisch-Embryo Proben von Bunt Ganze Berge<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

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Research

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Biology

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

24.1K Aufrufe.  University of Notre Dame.  Die Zebrafischembryo ist ein hervorragendes Modell für Entwicklungsbiologie Forschung. Während der Embryogenese entwickeln Zebrafisch mit einem Dottermasse, die dreidimensionale Herausforderungen für die Proben Beobachtung und Analyse präsentiert. Dieses Protokoll beschreibt, wie man zweidimensionale Flachmontage Zubereitungen der ganze Berg in situ (WISH) gefärbt Zebrafischembryo Proben erstellen. 

Serie: Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Verfahren zur Whole Mount Antikörper-Färbung in Küken

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Mit Whole Berg In situ Hybridisierung zu Molecular Biology und Organismal Link-

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Whole-mount Immunhistochemische Analyse für Embryonale Limb Haut Gefäßsystem: ein Modellsystem zur Vascular Branching Morphogenese in Embryo-Studie

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung in whole mount Embryonen und Histologie für Marine Elasmobranchs Angepasst

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Hohe Auflösung Ganze Berge<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung innerhalb Zebrafischembryonen Gene Expression und Funktion zu untersuchen

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...