Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse GM046406 (DB) und dem National Institute of General Medical Sciences Center for Quantitative Biology (GM071508) unterstützt. RSM räumt Mittel aus dem NSF Graduate Research Fellowship. MNM wird durch eine Lewis-Sigler Fellowship unterstützt. Wir möchten den Mitgliedern des Botstein Labor für hilfreiche Diskussionen und der ehemaligen Mitglieder Allegra Petti und Nikolai Slavov für ihre Beiträge zur metabolischen Zyklus Projekt bestätigen. Wir danken Daniel Zenklusen und Robert Singer für uns immer begann mit der FISH-Methode.

Abbildungen 1 und 2 sind schematische Darstellungen der FISH experimentellen Verfahren und Bildanalyse zur Quantifizierung Pipeline FISH Bildern verwendet. 1. Lösungen bereiten * Die folgenden Lösungen sind für den Einsatz mit Singer-Sonden. Bei Verwendung von Stellaris Sonden ersetzen &quot;40% Formamid&quot; mit &quot;10% Formamid&quot; sowohl Hybridisierung und Waschpuffer. Zusätzliche Änderungen an Hybridisierungspuffer bei Verwendung Stellaris Sonden sind (1) 1 g Dextransulfat und (2) nicht enthalten 10 mg ssDNA. Puffer B 8 ml 1 M KH 2 PO 4 41,5 ml 1M K 2 HPO 4 109,3 g Sorbit Spheroplasting Buffer 890 ul Puffer B 100 ul VRC 10 ul 25.000 U / ml Lyticase 2 ul β-Mercaptoethanol &lt;strong&gt; Hybridisierungspuffer (10 ml, Endvolumen) 10 mg E. coli tRNA 10 mg ssDNA * 100 ul 200 mM VRC Lager 40 ul von 50 mg / ml BSA 1 ml 20X SSC 4 ml 40% Formamid * Nuclease Free Water (bis 10 ml Endvolumen) 1 g Dextransulfat * * Hybridisierungspuffer kann in 0,5 ml Aliquots bei -20 ° C werden der Einfachheit halber beibehalten. Waschpuffer (50 ml, Endvolumen) 5 ml 20X SSC 20 ml 40% Formamid * Nuclease Free Water (bis 50 ml Endvolumen) Markierungspuffer 1,06 g Sodium Carbonate 100 ml DEPC Wasser pH 9 2. Probe-Kennzeichnung (Singer Probes Only) Wir erhalten diese Sonden durch in-house-Synthese unter Verwendung eines ABI Oligonucleotidsynthese Gerät. TypicAlly werden 4-5 ~ 50 bp Oligonukleotide synthetisiert, die homolog zu dem Gen von Interesse, substituierende Aminosäure-allyl Thymidin mehrere Thymidinen Abstand von mindestens 8, vorzugsweise 10 + bp auseinander. Aufgrund ihrer Empfindlichkeit gegenüber Ozon, arbeiten wir in einer Ozon-Anlage kostenlos bei der Verwendung von CY Farbstoffe. <ol><li> Erhalten ~ 5 Sonden und resuspendieren in 100 ul Wasser - check Konzentrationen auf Nanodrop. </li><li> Je nachdem, wie viele Sonden / Gen verbinden insgesamt 10 ug Oligonukleotide / Gen (zB wenn haben 5 Sonden / Gen wollen, dann 2 ug / Sonde). </li><li> Verwenden QIAquick Spalten Sonden nach QIAquick Nucleotide Removal Kit Protocol reinigen. </li><li> In 10 Bänden Buffer PN, um die Lautstärke des kombinierten Sonden und Mix insgesamt. </li><li> Bewerben Probe QIAquick Säule - wenn Gesamtvolumen größer als 750 ul, Spin-down zweimal mit der Hälfte des Volumens in jedem Spin </li><li> Lassen Sie stehen für 1 min. </li><li> Zentrifuge 1 min bei 6.000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Waschen mit 750 ul Puffer PE. </li><li> Zentrifuge1 min bei 6.000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Entsorgen Durchströmung und Re-Spin-Säule für 1 min bei 13.000 rpm zu trocknen. </li><li> Platz QIAquick Säule in neue Mikrozentrifugenröhrchens und eluieren DNA mit 50 ul H 2 O - Stellen Sie sicher, H 2 O pH innerhalb 7,0 und 8,5 und liegt direkt am Membran platziert. </li><li> Lassen Sie stehen für 1 min. </li><li> Säule für 1 min bei 13.000 rpm, um DNA zu eluieren. </li><li> Lyophilisiert DNA bei 45 ° C </li><li> Pellet in 10 ul Markierungspuffer und Rohr von Farbstoff hinzuzufügen, ohne den Farbstoff. </li><li> Wiederholen Sie mit einem anderen 10 ul Markierungspuffer. </li><li> Vortex und Spin-Down Tube Farbstoff und DNA. </li><li> Röhrchen abdecken mit Alufolie aus und halten in Dunkeln bei RT O / N zu bezeichnen. </li><li> Wiederholen QIAquick Nucleotide Removal Kit Protocol. Führen Sie mit zwei Unterschieden: - In 200 ul Puffer PN, Sonden und legte markierten Sonden durch Spalten 2x. - Führen Sie 3 Wäschen mit Puffer PE, um abzuwaschen ungebunden Farbstoff vor der Elution. </li><li> After Elution erhalten Konzentration über nanodrop. Die Kennzeichnung Effizienz ist in der Regel ~ 0,25 pmol / ng einzelner DNA. </li></ol> 3. Coverslip Vorbereitung <ol><li> Platz Deckgläser auf Objektträger in Plasma-putzen Vakuumkammer ( <a href="http://www.plasmapreen.com/" target="_blank">http://www.plasmapreen.com/</a> ) (die näher am Zentrum, desto besser). </li><li> Setzen Vakuumkammer in Mikrowelle und sicherstellen, dass es verschlossen ist. </li><li> Schalten Sie Pumpe zuerst, dann auf Vakuum nur einmal drehen Pumpe gestartet wird. </li><li> Schalten Sie Mikrowelle und stoppen 5 sec nach Plasma sichtbar ist. </li><li> Schalten Sie dann Vakuum pumpen. </li><li> Ziehen Sie Vakuumkammer und entfernen Deckgläser mit einer Pinzette (diejenigen, die gefallen muss wieder gereinigt werden). </li><li> Platz Deckgläser gereinigt Seite nach oben in 12-Well-Platten. </li></ol> 4. Fixation Vorgehensweise <ol><li> Wachsen Hefe bis zu einer OD 600 von ca. 0,1-0,2 in minimal Medien. 10 ml von Zellen liefert genug for ~ 10 separate Hybridisierungen. </li><li> 1/10 Volumen 37% Formaldehyd direkt an den Wachstums-Medien (10 ml Kultur + 1 ml 37% Formaldehyd) und lassen Sie sich für 45 min. </li><li> Waschen Sie 2x mit 1 ml eiskaltem Puffer B in einem Mikrozentrifugenröhrchen (kann bei 13.000 rpm für 1 min drehen). </li><li> 1 ml Spheroplasting Puffer. </li><li> Bei 37 ° C für 15 min. Prüfen Zellen alle paar Minuten unter dem Mikroskop, bis die meisten Zellen schwarz (dh nicht-Phase hell) sind. </li><li> 2x Waschen mit eiskaltem Puffer B, Schleudern bei niedriger Geschwindigkeit (~ 3.500 rpm). </li><li> 1 ml 70% EtOH, resuspendieren vorsichtig und lassen Sie über Nacht bei 4 ° C (unbegrenzt bei -20 ° C). </li></ol> 5. Hybridisierung Vorgehensweise <ol><li> Bereiten Sie die Hybridisierungslösung: zu 100 ul Hybridisierungspuffer, in der Regel 1-3 ul Sonde, dann Wirbel und Zentrifuge. Singer Sonden verwenden 8-10 ng Gesamt pro Sonde Set (dh pro Gen). Wir haben bis zu 3 Gene gleichzeitig mit 3 ver abgebildetschiedenen markierten Sonde setzt. </li></ol> Achten Sie darauf, die Hybridisierung Lösung auf Raumtemperatur erwärmen, bevor Sie es öffnen. Für Stellaris Sonden, ist es empfehlenswert, 4 separate Hybridisierungsreaktionen durch Zugabe von 1 ul jedes von 1:10, 1.20, 1:50 und 1:100 Verdünnungen von Sonden arbeiten, um zu sehen, welche optimal ist gestartet. Arbeiten Verdünnungen von Stellaris Sonden in Hybridisierungspuffer vorbereitet. <ol start="2"><li> Zentrifuge (für alle folgenden Schritte, 3.500 rpm, 5 min) die fixierten Zellen (z. B. 200 ul) und saugen das Ethanol entfernt. </li><li> Vorsichtig in 1 ml Waschpuffer, die den gleichen Prozentsatz Formamid als Hybridisierungspuffer enthält resuspendieren. Lassen Sie stehen für 2-5 min. </li><li> Zentrifuge Probe und absaugen Waschpuffer, dann fügen Hybridisierungslösung. Im Dunkeln unter leichtem Schütteln, O / N bei 37 ° C </li></ol> Hinweis: Die folgende Prozedur ist für die Anwendung / Bildgebung von Zellen auf Deckgläsern. Für wVeraschen / Bildgebung von Zellen in 96-Well-Platten, einschließlich anderer reaktiver Sauerstoffspezies Fängerlösung siehe <a href="http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols" target="_blank">http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols.</a> <ol start="5"><li> Am nächsten Tag, oder im Voraus, sauber (siehe Arbeitsgang) einsetzen und behandeln Deckgläschen mit 150 ul 0,01% Poly-L-Lysin für 5 min. Absaugen, trocknen lassen, 3x mit dH 2 O und trocknen lassen. </li><li> In der Früh, 1 ml Waschpuffer auf die Probe, sanft resuspendieren, Zentrifuge und absaugen, dann in einem anderen 1 ml Waschpuffer und Inkubation bei 37 ° C für 30 min resuspendieren. </li><li> Waschen mit 2X SSC + 0,1% Triton X-100 bei RT 15 min auf Schüttler. </li><li> Nehmen Sie den Einbau Medium aus der Tiefkühltruhe, damit sie kommen bis RT vor der Montage. </li><li> Waschen mit 1X SSC bei RT 15 min auf Schüttler. </li><li> Verdünnen DAPI in PBS (0,1 ug / ml final) und Zellen in 150 ul. </li><li> Platz Lösung auf gereinigt / Poly-lys-TREAten Deckgläschen in 12-Well-Platte, mindestens 30 min ungestört. </li><li> Lösung entfernen (Sie können es auf einem Ersatz-Deckglas als Backup zu platzieren) und waschen mit 1 ml 1X PBS 3x. </li><li> Platz 3 ul verlängern Goldmontageecken Medium auf einem Objektträger (Invitrogen P36934). Tun Sie dies ein zu einer Zeit, wenn Sie mehrere Deckgläser zu vermeiden Trocknen des Eindeckmediums haben. </li><li> In ~ 0,5 ml Ethanol in 12-Well-Platte Deckglas, entfernen Sie das Deckglas und der Luft trocknen lassen, während mit einer Pinzette. </li><li> Zeigen Deckglas Zell-Seite nach unten auf Eindeckmediums und lassen verhärten mehrere Stunden oder O / N in der Dunkelheit. </li><li> Seal die Ränder mit Nagellack und fahren Bildgebung. </li></ol> 6. Imaging von Zellen mit Olympus IX-81 Inverses Mikroskop Übersicht <ol><li> Für die Bildaufnahme nutzen wir Slidebook (intelligent-imaging.com) Software und ein 100X, 1,45 NA, TIRFM Öl-Objektiv. Für die serielle GFP, DAPI, Cy3, Cy5 und Cy3.5 imaging: Chroma-Filter-Sets (siehe Reagenzien). </li><li> Verwenden DAPI-Filterzu finden und zu konzentrieren Zellen. </li><li> Setzen Sie diese als Bezugspunkt. </li><li> Werfen Sie einen z-Stapel von Bildern rund um den Bezugspunkt, wo die Gesamtstrecke beträgt 5 uM mit 0,2 uM Größe (25 Flugzeuge). Wiederholen Sie dies für jeden Farbstoff Kanal (dh jede Sonde set). </li><li> Export als 16-Bit-TIFF für die Bildanalyse. </li></ol> 7. Bildanalyse Übersicht (Singer Probes) Im Folgenden geben wir einen Überblick über Berechnungsmethoden verwenden wir zur Analyse FISH Bilder in MATLAB. Die relevanten MATLAB-Funktionen verwendet werden, auf der rechten eingeklammert. Die Algorithmen und Schwellenwerte sind derzeit für Daten aus Singer-Sonden abgestimmt. Mit Stellaris-Sonden erfordert einige Anpassungen, insbesondere auf die endgültige Filterung Schritt (7.8). Zellidentifikation 15 <ol><li> Separate Zellen aus dem Hintergrund mit einem globalen Schwellwert auf DAPI Bilder 16 [graythresh]. </li><li> Identifizieren Kerne mit erweiterten Maxima-Funktion [imextendedmax]. </li><li> Segment Zellen mit Kernen als Keime für eine Wasserscheide-Algorithmus [Wendepunkt]. </li></ol> Finden Sie wichtige Punkte in jeder Fluoreszenzkanal <ol start="4"><li> Führen tophat Transformation Hintergrund normalisieren und verbessern Signal-Rausch-Verhältnis [bwmorph]. </li><li> Finden Maxima, die In-Fokus-Schicht (in der z-Ebene) für jeden Punkt zu identifizieren [imregionalmax]. </li><li> Filtern Potenzial Flecken mit einem linearen Modell fit zu einem radialen Farbverlauf. </li></ol> Measure Spotintensität und Filter einzigen vs mehrere Sondensignale <ol start="7"><li> Fit ein 2D-Gauß-Profil an die Stelle in der zuvor identifizierten In-Fokus-Schicht und Schätzung Intensität 17. </li><li> Filtern Sie Schwachstellen mit einer Schwelle (basierend auf Histogramm). Für Singer-Sonden das ist wichtig, aber es ist weniger für Stellaris Sonden. </li><li> Graf Flecken in jeder Zelle. </li></ol>

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Bis heute hat FISH in erster Linie ein Low-Durchsatz-Methode. Die Verwendung von Cy3, Cy3.5, Cy5 Farbstoffen und begrenzt die Anzahl der Gene in einem einzelnen Zellen zu drei untersuchen können zu einem Zeitpunkt. Einige zusätzliche Sonden entwickelt (Stellaris), aber die Anzahl der unterscheidbaren Sonden noch höchstens sieben. Um diese Einschränkung zu umgehen, wurden kombinatorische Kennzeichnung Strategien mit mehreren Fluorophoren verwendet worden, um Barcodes für verschiedene mRNA-Spezies 19,20 erstellen. Zuletzt verwendet Lübeck und Cai optische und spektrale barcoding zu 32 verschiedene Arten gleichzeitig zu quantifizieren mit FISH in einzelnen Hefezellen 19. Eine Einschränkung dieser jüngsten kombinatorischen Ansatzes ist es erfordert die Verwendung von Super-Resolution-Mikroskopie. Die Analyse erforderlich, um die Barcode-Sonden unterscheiden ist auch sehr komplex. Wir haben festgestellt, dass Cy3 und Cy5 Cy3.5 vorzuziehen, für FISH Experimente sind. Eine der Einschränkungen des Cy5-Farbstoff ist seine Empfindlichkeitzum Bleichen. Allerdings hat kürzlich Stellaris Cy5 Varianten, die als resistenter gegen Ausbleichen beworben werden entwickelt und können diese technische Frage zu lindern. Es auch erwähnenswert, dass Fisch ist ein teures Verfahren zu implementieren und dass sowohl Sänger und Stellaris Sonden in der Regel kosten $ 700 - $ 1.000 pro Sonde gesetzt, obwohl die Preise für kommerziell erhältliche Sonden in der Zukunft verringern sollte. Sparing von Reagenzien und effiziente Markierung bringt Singer Sonden bis in den unteren Bereich im Preis. Eines der größten technischen Herausforderungen ist die Trennung von einzelnen gegen mehrere Sonde Flecken, die die Umsetzung von anspruchsvollen spot-Bestimmung Algorithmen erfordert. Dies kann umfangreiche manuelle Überprüfung der Bildanalyse Parameter für bestimmte Versuchsanordnungen abzustimmen. Ein Überblick über unsere Computational Pipeline mit relevanten MATLAB-Funktionen wird in Abschnitt 7 des Protokolls zur Verfügung gestellt. Dieses Problem wird durch die Stellaris etwas Sonden, die nur gelindert<html> ein Etikett pro Sonde. Es erfordert daher die Kolokalisation von mehreren Sonden, um ein Signal zu sehen. Da FISH erfordert Festsetzung Zellen, es nicht ermöglichen Tracking einzelnen Zellen über die Zeit. Früher verwendeten wir FISH Snapshot-Daten, um die Dynamik der Genexpression in einzelnen metabolisch Radfahren Hefepopulationen 6 rekonstruieren. Metabolic Radfahren wird in Pre-verhungert, kontinuierliche Kulturen beobachtet, und wird von der Bevölkerung-weiten kollektiven Schwingungen in Sauerstoffverbrauch gekennzeichnet. Diese Schwingungen werden mit Genom-weiten Schwingungen Transkripte, die für die Hälfte aller Hefegenen treten in verschiedenen Phasen der Sauerstoffverbrauch verbunden. Wir versuchten zu bestimmen, ob metabolische Radfahren war in synchronisierten kontinuierliche Hefekulturen. Falls vorhanden, sollten Transkripte, die in synchronen Bevölkerung anti-korreliert sind auch anti-korrelierte in einzelnen Zellen nicht synchronisiert, und umgekehrt für korrelierte Transkripte. ent &quot;&gt; Zur Dynamik der mRNA-Produktion in der Zeit zu rekonstruieren, müssen die beobachteten Snapshot-Daten zu dem, was von einem Modell des zugrunde liegenden Verhalten erwartet verglichen werden. Es gibt theoretische Einschränkungen, wenn diese&quot; Schnappschüsse &quot;der Genexpression Daten können verwendet werden, um festzustellen, die zugrunde liegenden Genexpression Dynamik und die Arten von Modellen 21 unterschieden werden können. Für die metabolische Zyklus Daten, anstatt direkt zeigt das Vorhandensein von zeitlichen Oszillationen wurden statistische Messungen durchgeführt, um zu belegen, dass es tatsächlich eine Zelle autonomen oszillierende Programm mit Bulk-Microarray Messungen.

Mit bulk Messtechniken, ist es nicht möglich, die Anzahl der Test-Transkripte oder transkriptionelle Aktivität in einzelnen Zellen 1. Mit fluoreszierenden Proteinen durch Promotoren von Interesse als Reporter der Genexpression angetrieben können dieses Problem in gewissem Umfang anzugehen, aber die Zeit für fluoreszierende Proteine ​​zu falten erforderlich verdeckt frühen Dynamik. Langlebige fluoreszierende Proteine ​​können auch nicht berichten mRNA Lebenszeiten. Die FISH-Methode kann zum Testen mRNA während seines gesamten Lebenszyklus genutzt werden, von Transkriptionsinitiation in den Zellkern, um nachfolgende Reifung und Zerfall in einzelne Zellen, mit Einzel-Molekül-Auflösung. Das Original in situ Experimente zur Visualisierung von Nukleinsäuren verwendet radioaktiv markierte RNA-Sonden mit DNA-Elementen untersuchen. Dazu gehörten Visualisierung ribosomalen DNA in den Eierstöcken der Frosch Xenopus laevis 2 und Satelliten-DNA in Mausgewebe 3. Die erste Fluoreszenz in situ Knowführungsform verwendet ein RNA-Molekül mit einem Fluorophor markiert Sonde DNA-Sequenzen, insbesondere 4. Die erste Anwendung von fluoreszierenden Sonden zur Visualisierung RNA in situ war die Visualisierung von Aktin Genexpression in Hühnermuskel Gewebekulturen 5. In jüngerer Zeit in Hefezellen, FISH wurde verwendet, um Schwingungen in der Transkription zu untersuchen während der Hefe Stoffwechselkreislauf 6, der Zerfall der mRNAs während des Zellzyklus 7 und räumliche Lokalisierung der mRNA-Transkripte der Mitose 8. Fisch hat in Hefe verwendet worden, um zu zeigen, dass unkorrelierte Schwankungen konstitutiv transkribierten Gene, die mehr als die Hälfte aller Hefegenen bilden, von unkorrelierten Transkriptionsinitiation 9 entstehen. In Nicht-Hefe-Arten, hat FISH verwendet worden, um Stammzell-Marker in der Mausdarm 10 zu identifizieren und zu bestimmen, dass unvollständige Penetranz Zellschicksale kann von stochastischen Schwankungen Genexpression in C. führenelegans Embryonen 11. Die FISH hier beschriebene Verfahren arbeitet durch Hybridisierung Farbstoff markierte, einzelsträngige DNA-Sonden, um Nachrichten mRNA. Zellen abgebildet werden und mRNAs gezählt mit einer Spot-Detektion Algorithmus. Einzelsträngige Sonden können mit einem DNA-Synthesizer erzeugt werden und dann mit (hier bezeichnet als Singer Sonden) oder bestellt kommerziell als pre-markierten Sonden (Stellaris Sonden) 12,13. Ein wesentlicher Unterschied zwischen dem Sänger und Stellaris Sonden ist, dass die Sänger Sonden mehr (~ 50 bp) und sind multi-markierten Sonden während die Stellaris (~ 20 bp) mit nur einem Etikett pro Sonde, wie Raj et al beschrieben sind kurz 14. Darüber hinaus verwendet der Stellaris Ansatz viele weitere Sonden pro Gen als die von Singer (~ 30 gegenüber 5 Sonden pro Gen, respectively). Nachfolgend wir ein Protokoll, das die Verwendung eines der Art der Sonde beschrieben. In Abschnitt 2 stellen wir ein Protokoll für die Kennzeichnung Amino-allyl Thymidin enthaltenden Sonden wit einem Farbstoff Cy gewählt. Eine Übersicht über die Rechenschritte erforderlich, um einzelne mRNA-Spots zu identifizieren ist in Abschnitt 7 vorgesehen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadyl Ribonucleoside Complex</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1402S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyticase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5263</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1010954001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03446l</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI, dilactate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9564</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9624</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Shelton Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6001</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline-sodium citrate (SSC) 20X</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82021-484</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (deionized)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9342</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3155</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>150710</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylysine (0.01%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>Cs-18R15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28304</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Probes</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Custom order for your desired mRNA sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 96-well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>265300</td>
			<td>Alternative to coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>monofunctional NHS-ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Preen I Cleaner</td>
			<td>Terra Universal</td>
			<td>9505-00</td>
			<td>Controller (Cat #9505-17 optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Alcatel</td>
			<td>205SDMLAM</td>
			<td>For operating Plasma-Preen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-UB617R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>X-Cite</td>
			<td>XCT 10-A</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Sets</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled CCD or EMCCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C4742-98-24ER</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of mrna molecules using fluorescence in situ hybridization in saccharomyces cerevisiae

Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) erlaubt es, Nukleinsäuren in der nativen zellulären Umgebung zu erfassen. Hier bieten wir ein Protokoll für die Verwendung von FISH, um die Anzahl von mRNAs in einzelnen Hefezellen zu quantifizieren. Die Zellen können in einem Zustand von Interesse angebaut werden und dann fixiert und durchlässig gemacht. Anschließend werden mehrere einzelne Desoxyoligonukleotiden konjugiert verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe zur Markierung und zu visualisieren mRNAs. Beugungsbegrenzte Fluoreszenz von einzelnen mRNA-Moleküle wird unter Verwendung eines Spot-Algorithmus zu identifizieren und zählen die Anzahl der mRNAs pro Zelle. Während die mehr Standard-Verfahren zur Quantifizierung von Northern Blots, RT-PCR und Genexpression-Microarrays Informationen über durchschnittliche mRNAs in der Bulk-Bevölkerung stellen, erleichtert FISH sowohl die Zählung und Lokalisation dieser mRNAs in einzelnen Zellen auf Einzel-Molekül-Auflösung.

Abbildung 3 zeigt typische Histogramme von FISH Bilder berechnet und verwendet, um die Anzahl der mRNAs in einzelnen Zellen zu bestimmen. Ein wichtiger Vorteil der Mikroskopie-basierte RNA Quantifizierung ist, dass man Informationen über die Lokalisation der Transkripte zu erhalten. Zum Beispiel haben wir FISH auf mRNAs in einzelnen Zellen mit einem induzierbaren CBF1 Allel (Abbildung 4) zu identifizieren. Da viele mRNA Moleküle am Ort der Transkription sind, sind wir in der Lage, das Vorhandensein und die Lage der Transkription Stellen innerhalb des Kerns zu identifizieren. Durch die Verwendung unterschiedlicher Farbstoffe zur Kennzeichnung mRNAs von verschiedenen Genen, kann man mehrere mRNA-Spezies in den gleichen Zellen zu quantifizieren. Um dies zu demonstrieren, wurden Hefe-Zellen in Gegenwart von α-Faktor und Sorbitol inkubiert. FUS1 Transkription (Quasar670 Farbstoff, rot) wird durch α-Faktor induziert. STL1 Transkription (Quasar 570 Farbstoff, grün) wird durch Erhöhung der extrazellulären Osmolarität induziert ( <strong&gt; Abbildung 5). Abbildung 4 ist ein Beispiel von FISH-Sonden mit den Singer. Abbildung 5 ist ein Beispiel von FISH-Sonden mit den Stellaris. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der FISH experimentelle Verfahren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50382/50382fig1large.jpg" target="_blank">Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung der Bildanalyse-Pipeline. Die letzten Punkte werden in der rechten Figur bestimmt. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig3.jpg" /> Abbildung 3. Histogramm Spotintensitäten für ein bestimmtes Gen mit Singer Sonden </strong&gt;. Probe Intensitäten sowohl innerhalb (rot) und außerhalb (blau) Zellen berechnet. Niedrige Intensität Flecken sind entweder Rauschen oder einzelne Sonden. Echter mRNA Nachrichten werden mit mehreren Sonden markiert. Bei der Verwendung von Stellaris-Sonden sind Sonden einzelne weniger nachweisbar und damit die Schwellen und die Filterung entsprechend angepasst werden müssen. <img alt="Fig. 4" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig4.jpg" /> Abbildung 4. Repräsentative Ergebnisse von Singer FISH-Verfahren. In diesem Experiment wird CBF1 Transkription mit einem induzierbaren Promotor 18 aktiviert. Zellkerne sind blau angefärbt mit DAPI. CBF1 mRNAs mit Cy3-markierten Sonden sind verschlagwortet. Weiße Pfeile markieren die Anwesenheit von CBF1 Transkription Websites in den Zellkern. Einzel-mRNA-Transkripte sind im Zytoplasma. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig5.jpg" /> Abbildung 5. Repräsentative Ergebnisse von Stellaris FISH-Verfahren. MATa Hefezellen wurden gleichzeitig 30 ng / ml α-Faktor und 0,75 M Sorbitol für 10 Minuten ausgesetzt und gleichzeitig sondiert FUS1 (Quasar 670, rot) und STL1 (Quasar 570, grün) Transkripte. In dem markierten Feld können wir sehen, eine Zelle reagiert nur auf das Pheromon (FUS1 Startstelle, rot) und ein anderer überwiegend Reaktion auf Sorbit (STL1 Startstelle, grün).

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Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Verfahren für die Durchführung Fluorescence<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH) zum Zählen mRNAs in einzelnen Zellen auf Einzel-Molekül-Auflösung.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

visualization-analysis-mrna-molecules-using-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

34.6K Aufrufe.  Princeton University. Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Verfahren für die Durchführung Fluorescence In situ Hybridisierung (FISH) zum Zählen mRNAs in einzelnen Zellen auf Einzel-Molekül-Auflösung.

Serie: Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Forschung

Biologie

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH)-Protokoll in menschlichen Spermien

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Die Messung der mRNA-Abbau Preise in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Verwenden<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Die Stämme

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA<em&gt; In-situ-</em&gt; Die Hybridisierung an Squashed Chromosomen

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.