Die Autoren danken der ehemaligen und derzeitigen Mitarbeitern des Labors für Beiträge zur Entwicklung der Methodik hier skizzierten und Alan Cochrane um Rat fragen. LA ist ein Empfänger einer kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) Doctoral Fellowship und AJM wird von einem Fraser, Monat und MacPherson Career Award unterstützt. Diese Arbeit wird durch einen Zuschuss aus dem CIHR (Grant # MOP-56974) unterstützt.

1. Sondenvorbereitung <ol><li> Digest 1 ug die in vitro Transkription Vektor, ausgeführt pKS (+) Pol 236nt 9 mit Kpn1 Enzym bei 37 ° C für 1 Stunde und des linearisierten DNA-Produkt auf einem Agarosegel. Das Fragment sollte etwa 2500 bp sein. </li><li> Schneiden Sie das Fragment aus dem Gel gereinigt und unter Verwendung des Roche Micro Elute Gel Extraction Kit (alle verwendeten Reagenzien sind in Tabelle 1 aufgeführt). Führen Sie die endgültige Elution in 30 ul Elutionspuffer. Versuch 5 ul des Produkts auf einem Agarosegel, um die Reinigung zu überprüfen. </li><li> Mischen Sie ein in vitro-Transkriptions-Reaktion (siehe Rezept unten) unter Verwendung des Roche DIG RNA Labeling Kit und bei 37 ° C für 2 Stunden. </li></ol> In-vitro-Transkriptions-Reaktion: <table border="1"><tbody><tr><td> Linearisierte DNA </td><td> 23 ul </td></tr><tr><td> 1X DIG RNA Labeling Mix (Roche) </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> 1X Transcription Puffer </td><td> 8 ul </td></tr><tr><td> 20U RNase OUT </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> 80U T7-RNA-Polymerase </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 40 ul </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> In 228 U DNase I und bei 37 ° C für 15 min. </li><li> Stoppen der Reaktion durch Zugabe von EDTA pH 8,0 bis zu einer Endkonzentration von 20 mM. </li><li> Reinigung der Reaktionsprodukte mit Hilfe der Quick Spin Columns von Roche als vom Hersteller angegeben. </li><li> Reinigen der Sonde durch Fällung mit 1/10 Volumen DEPC-behandeltem 3M NaOAc pH 5,2 und 2,5 Volumina eiskaltem 95% igem Ethanol. Mischen und inkubieren bei -80 ° C für 30 min bis über Nacht. </li><li> Zentrifuge die Sonde für 15 min bei 4 ° C bei 15.000 × g. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und wasche das Pellet in eiskaltem 70% Ethanol. Zentrifuge erneut für 5 min bei 4 ° C bei 15.000 × g. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und das Pellet trocknen. Das Pellet in 50 ul wasser (DNase / RNase frei) mit 10 U RNase OUT Invitrogen. </li><li> Schätzen Sie die Konzentration der Sonde durch Spektrophotometrie (Maßnahme RNA bei 260 nm), und mit Wasser auf eine Konzentration von 5 ng / ul. Shop in Aliquots bei -20 ° C für den kurzfristigen Einsatz, oder -80 ° C für eine langfristige Lagerung. Es wird empfohlen, inter-Assay-Vergleiche durchführen, so erhalten einen aliquoten dafür. </li></ol> 2. Zellfixierung <ol><li> Es ist zunächst wichtig, Samen anhaftenden Zellen auf unbehandelten, sterile Deckgläschen so dass die endgültige Konfluenz bei der Ernte beträgt ca. 70-80%. Für nicht-adhärenten Zellen, als normal wachsen und bei Empfang genommen werden, inkubieren mit Deckgläschen, die mit 0,01% w / v Poly-L-Lysin (Sigma-Aldrich, Inc.) wurden für 1 Stunde behandelt. Für einen typischen 12-Well-Polystyrol-Gewebekulturplatte (3,8 cm 2), 150.000 Zellen (zB HeLa) nach 24 Stunden vor der Transfektion ausplattiert. Nicht-adhärente Zellen kann infiziert oder transfiziert werden wie üblich und man ließ sie adSie hier, um Glasdeckgläschen vor der Fixierung 3. </li><li> Entsorgen Sie die Medien und waschen Sie die Zellen mit 1X Phosphat-gepufferte Salzlösung in doppelt destilliertem Wasser (DPBS) für 1 Minute vorbereitet. Diethylpyrocarbonat (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc.) behandelt 1X PBS können ebenfalls verwendet werden, kann jedoch nicht als unbehandelte PBS darin enthaltener RNase Enzymen. </li><li> Entsorgen Sie die PBS und fügen Sie 4% Paraformaldehyd, genug, um die Zellen vollständig zu bedecken. Inkubieren Sie für 15-20 min. </li><li> Entsorgen Sie die paraformaldeyhyde und waschen Sie die Zellen mit 1X DPBS für 1 min. </li><li> Entsorgen Sie die DPBS und fügen 0,1 M Glycin (gelöst in 1X DPBS). Inkubieren für 10 min. </li><li> Entsorgen Sie das Glycin und waschen Sie die Zellen mit 1X DPBS für 1 min. </li><li> Entsorgen Sie die DPBS und fügen 0,2% Triton-X (gelöst in 1X DPBS). Inkubieren Sie für 5-10 min. Wenn Färbung für nukleolären oder Kernhüllenproteine, mit Triton X-100 nicht länger als 5 min oder die Protein-Lokalisierung wird diffus permeabilisieren. </li><li> Entsorgen Triton X-100 und wasche einmal in1X DPBS für 1 min. </li><li> Für die langfristige Lagerung, ersetzen PBS mit 70% Ethanol und lagern bei 4 ° C für bis zu vier Monate. Alternativ dazu noch einmal abwaschen mit 1X DPBS und fahren um zu fischen. </li></ol> 3. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) <ol><li> Wenn die Deckgläser in Ethanol gelagert wurden, ersetzen Ethanol mit 1X DPBS und die Zellen für 30 Minuten zu rehydrieren. Rehydrierung kann über Nacht geschehen, wenn die Deckgläser bei 4 ° C gelagert werden </li><li> Waschen Sie die Deckgläser mit 1X DPBS für 1 min. </li><li> Bereiten Sie Folien, die auf Deckgläsern inkubieren, wobei darauf zu reinigen und zu beschriften Sie sie gut. </li><li> Für eine 18mm Deckglas, fügen Sie 50 ul DNase-Lösung (25 Einheiten / Deckglas, im Handel erhältlich) auf den Objektträger. Fügen Sie das Deckglas und achten Sie darauf, um es zu Zell-Seite Platz nach unten, und inkubieren Sie sie für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Deckgläser mit 1X DPBS für 1 min. </li><li> Dann werden 50 ul Hybridisierungs-Mix (siehe Rezept unten) pro Deckglas aufeine Rutsche und bebrüten das Deckglas Zelle nach unten für 16-18 h bei 42 ° C Die Inkubation sollte in einem Behälter mit 50% Formamid, 2 × SSPE Mischung (12,5 ml deionisiertes Formamid, 2,5 ml 20X SSPE, 10 ml Wasser) durchgeführt werden. </li></ol> Hybridisierung Mix (für ein Deckglas, 50 ul): <table border="1"><tbody><tr><td> Anzahl der Aktien </td><td> Material (bei ​​Endkonzentration) </td></tr><tr><td> 25 ul </td><td> Formamid, 50% (entionisiertem, jede Quelle) </td></tr><tr><td> 5 ul (von 10 mg / ml) </td><td> tRNA, 1 mg / ml (Sigma-Aldrich, Inc.) </td></tr><tr><td> 5 ul (der 20X) </td><td> SSPE, 2X </td></tr><tr><td> 5 ul (50 ×) </td><td> Denharts, 5X </td></tr><tr><td> 0,125 ul (von 5 Einheiten) </td><td> RNase OUT </td></tr><tr><td> 5 ul (25 ng von 5 ng / ul) </td><td> Sonde </td></tr><tr><td> 5 ul </td><td> H 2 O DEPC, um die endgültige machenVolumen 50 pl </td></tr></tbody></table><ol start="7"><li> Inkubieren Deckgläser Zelle nach unten in 50 l 50% Formamid (verdünnt in 1 × DPBS) für 15 min bei 42 ° C </li><li> Waschen der Deckgläser zweimal in 2 × SSPE durch Inkubation Zelle nach unten in 50 ul 2X SSPE (20 × SSPE in 1X DPBS verdünnt) für jeweils 5 min bei 42 ° C </li><li> Waschen Sie die Deckgläser in 1X DPBS für 1 min. </li></ol> 4. Immunfluoreszenzfärbung <ol><li> Blockieren Sie die Deckgläser Zelle, indem sie sie nach unten in 50 l 1X Roche Blocking-Lösung (10X Roche Blockierungslösung in 1X DPBS verdünnt) für 30 min. </li><li> Inkubieren Sie die Deckgläser Zelle nach unten in 50 ul primären Antikörper-Lösung 1 h bei 37 ° C Anti-DIG-Antikörper sollte gemäß den Herstellerangaben Richtung in 1 × Blockierungslösung verdünnt werden. Wenn andere Antikörper verwendet wird, um Proteine ​​zu färben, kann sie an der richtigen Konzentration bereitgestellt hinzugefügt werden, dass alle verwendeten Antikörper aus verschiedenen Host-Spezifikation abgeleiteties. </li><li> Waschen Sie die Deckgläschen für 10 min in 1X DPBS. </li><li> Inkubieren Sie die Deckgläser Zelle nach unten in 50 l sekundären Antikörper-Lösung 1 h bei 37 ° C Alexa Fluor-konjugierte Antikörper (Invitrogen) verwendet werden, um einen Bereich von Farben zu erzeugen und an 1:500 in Blocking-Lösung 1X, 1X DPBS verwendet. </li><li> Waschen Sie die Deckgläser zweimal für jeweils 10 Minuten in 1X DPBS. </li><li> Trocknen Sie die Deckgläser Zelle nach oben auf Whatman-Papier. Beachten Sie unbedingt die Deckgläschen abdecken, um Belichtung und Bleichen zu vermeiden. </li><li> Sobald alle Flüssigkeit verdampft ist, montieren Sie die Deckgläser auf frische Dias mit 8 ul ImmunoMount (Thermo Scientific, Inc.). Klopfen Sie sich das Deckglas, um mögliche Luftblasen zu beseitigen. </li><li> Bewerben Nagellack zu den Kanten des Deckglases, um es zu fixieren. </li><li> Die Visualisierung von RNA und Proteinen durch Mikroskopie-Techniken ist auch entscheidend für den Erfolg dieser Technik. Einstellungen am Mikroskop eingesetzt werden können fördern oder behindern Visualisierung so ist, dass der SchlüsselEinstellungen am Mikroskop richtig eingestellt sein und konsequent sein von einer Probe zur anderen in einem gegebenen Experiment. Für detaillierte Mikroskopie Einstellungen finden Optik-und Antikörper-Kombinationen siehe Referenzen 1,10. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel der Virus-RNA-Färbung kann in 2 gesehen werden. Die virale RNA von HIV-1 wird im Cytoplasma diffus zum größten Teil angezeigt gesehen, obwohl kleines Cytoplasma Tränenpünktchen nicht ungewöhnlich sind. Die Spezifität kann durch den Vergleich positiver Zellen in die umliegenden Zellen, die keine Fluoreszenz Display abgelesen werden. Wie in der Einleitung erwähnt, erzeugt HIV-1, die die regulatorischen Rev-Protein fehlt RNA, die im Kern gehalten wird: das man sich als helles Signal im Kern kann, und einen Mangel an RNA Fluoreszenzsignal im Zytoplasma. Die Überexpression von zellulären Proteinen ist auch, das fähig ist die Verteilung der HIV-1 Virus-RNA. In Abbildung 2 </strong&gt;, die Überexpression von Proteinen in endosomalen Vesikel Menschenhandel verwickelt sind (z. B. Rab7-Interaktion lysosomalen Proteins (RILP) 11 oder N-terminal deletierten RILP (RILPN) 11, und Proteine, die mit Dynein motorischen Funktion beeinträchtigen [zB p50/dynamitin 1, 12], mit dem normalen steady-state Lokalisation der viralen genomischen RNA, wie durch FISH-Analysen bestimmt stören RILP Ausdruck führt wieder Lokalisation der viralen genomischen RNA an die Mikrotubuli-Organisation Zentrum (MTOC) 13;. RILPN verteilt späten Endosomen innerhalb der Zytoplasma aufgrund der Unfähigkeit, sich an p150 der Dynein motorischer Komplex p50/dynamitin Blöcken 14 und die große Untereinheit der Dynein Motor und Meldungen geklebtem binden späten Endosomen, sondern auch die virale genomische RNA und HIV-1 Proteinen zu der Zellperipherie 1 (Abbildung 2). Die Manipulation der Steady-State-Lokalisation der viralen genomischen RNA, einen wichtigen Beitrag zu der InfektiositätViruspartikel, wäre der Schlüssel zur späteren Entwicklung von Therapeutika. In unseren Händen, erscheint viraler RNA in der Zelle schon nach 3 Stunden nach der Transfektion und Infektion 10 und wird leicht beobachtbaren dieses FISH-Technik von 12 Stunden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ablaufplan des Protokolls über Fisch / IF Co-Analysen. Die Zellen werden auf Deckgläsern gezüchtet und dann mit Paraformaldehyd fixiert. Behandlungen von Glycin und Triton-X durchgeführt werden, bevor die Zellen entweder für FISH / IF verwendet oder gelagert in 70% Ethanol für die Lagerung. Die Zellen dehydriert für die Lagerung sind in 1X DPBS (DEPC-behandeltem PBS) bevor es weiter nach FISH / IF rehydriert. Die Zellen werden mit DNase I behandelt und über Nacht stehen gelassen, um mit der Sonde hybridisieren. Sobald Hybridisierung abgeschlossen ist, werden die Zellen gewaschen, mit Formamid, sowie mit SSPE, und eine letzte 1X DPBS spülen. Blockierungslösung wird auf die Zellen aufgebracht, gefolgt von Inkubation mitdie primären Antikörper. Nach dem Waschen werden Sekundärantikörper aufgetragen. Zwei abschließende Waschungen in 1X DPBS runden das Färbeverfahren, wo auf die Deckgläser getrocknet und auf Objektträger für die Bildgebung. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse unter Verwendung von FISH / IF Co-Analysen. A) HIV-1 wird in HeLa-Zellen und in einigen Fällen mit Konstrukten, die die Überexpression von zellulären Proteinen (RILP, p50/Dynamitin und RILPΔN (eine Amino-Deletionsmutante) zu transfiziert) . FISCH / IF Co-Analysen durchgeführt: RNA ist in grün entweder mit oder G3BP LAMP1 (rot) identifiziert zu unterscheiden. B) HIV-1 wird in HeLa exprimiert und gesammelt zu verschiedenen Zeitpunkten. Viral RNA-Expression wird in grün verfolgt, während die zellulären Proteins, hnRNP A1, in rot gefärbt wird. Größe Bars sind 10 um. Bilder von Referenzen 1 (select Zahlen aus Feld A; RILP, p50/Dynamitin und RILP DeltaN) geändertund 17 (Feld B).

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333, 642-646 (2011).</li><li>Eckhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SNAP-tagged+derivative+of+HIV-1--a+versatile+tool+to+study+virus-cell+interactions.">A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions.</a> PLoS One. 6, e22007 (2011).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

FISCH / IF Co-Analysen ist eine zuverlässige Methode zur Erkennung viraler RNA in Zellen, die inzwischen verfeinert 9,15,16 visualisieren. Im Laufe von mehreren Jahren haben wir eine raffinierte Methode der Färbung für RNA entwickelt. Diese Technik kann auf einer Vielzahl von Zelltypen sofern die Sonde spezifisch an die Ziel-RNA 17 verwendet werden. Durch die Markierung der Sonde mit DIG, sind wir imstande, die Visualisierung der RNA durch eine einfache Färbung. Wenn für die RNA-Färbung und anderen Proteinen kombiniert werden, FISH / IF Co-Analysen zu einem mächtigen Werkzeug, um zelluläre Strukturen und Protein / RNA-Lokalisierung zu beobachten. Die Spezifität der RNA-Detektion ist ziemlich hoch. Dies ist in 2 dargestellt. In einigen der ursprünglichen Arbeiten, die auf viralen genomischen RNA-Lokalisierung, FISH festgestellt, dass ein Mangel an Rev virale RNA im Zellkern 18 gefangen konzentriert. Da dies hat reichlich neue Informationen über die viralen genomischen RNA Lokalisation wurde unter Verwendung des technique hier skizzierte. Durch Überexpression von zellulären Proteinen, können bestimmte Populationen und nicht alle-der viralen RNA gezwungen, zu den verschiedenen Regionen der Zelle lokalisiert werden. RILP Überexpression, welche den Phänotyp erinnert erhalten wird, wenn hnRNP A2 wird durch siRNA in erschöpften HIV-1-exprimierenden Zellen 13, bewirkt, dass die RNA sichtbar zu der MTOC ansammeln. P50/Dynamitin Überexpression oder Knockdown der Dynein schwere Kette 1 führt zur Freisetzung von viralen genomischen RNA aus intrazellulären Domänen der zellulären Peripherie (: Die viralen genomischen RNA kann an der Zellperipherie, indem Sie die Minus-Ende Motorprotein, Dynein geschoben werden Abbildung 2). Eine Mutante von RILP, RILPΔN, die nicht mehr bindet das Dynein-Motor, zerstreut Endosomen (markiert durch LAMP1) in das Zytoplasma, weil sie nicht mehr aktiv an juxtanuclear Domänen lokalisiert sind. Diese Ergebnisse weisen auf die Vorstellung von einem Kunststoff-Population von HIV-1-Genom-RNA und insbesondere, dass verschiedene Pools von HIV-1-Genom-RNA mit teilweise identifizierbaren Rollen in der viralen Replikationszyklus abgegeben. Diese dieselben Begriffe bereits für das Protein von dieser mRNA kodiert Gag 19 identifiziert. Es gibt Einschränkungen für die Verwendungen der FISH / IF Co-Analysen, die auf Antikörper nach Wahl und Verfügbarkeit verbunden sind. Die Optimierung der besten Kombination aus primären und sekundären Antikörper und deren Konzentrationen, wird einige Zeit dauern, um zu optimieren (siehe Tabelle 1 und 2). Antikörper aus Hybridomen gemacht oder von großen Unternehmen hergestellt werden müssen, die überall Konzentrationen variieren von 1:2 bis 1:2000, aber sicher sein, um die Leitlinien der vom Hersteller für beste Ergebnisse befolgen. Die Wirt, in dem der Antikörper produziert muss auch unter Betracht gezogen werden. Mixing Schafe mit Ziegen-Antikörper sollte auch im primären und sekundären Antikörpern, da diese Kombination führt zu hohen Hintergrund durch cross-species Anerkennung (Daten nicht gezeigt) vermieden werden. Für Alexa-Fluor secondary Antikörper, kann die Konzentration an 1:500 für fast jede Antikörper in der Menge verwendet werden. Der andere Nachteil bei FISH / IF Co-Analysen in diesem Bericht beschrieben wird, ist es erfasst die RNA an seinem Standort im Steady-State, nachdem Zellen behoben wurden und permeabilisierten mit Paraformaldehyd und Reinigungsmittel (Abbildung 1). Jedoch hat sich die RNA Bildgebung in lebenden Zellen durch eine Vielzahl von Mitteln erreicht 20-22, meist unter Verwendung von Variationen der viralen RNA-Genome, die durch fluoreszierende Proteine, wie zB GFP versehen sind. Jedoch weiterhin zusätzliche Mittel an die RNA-Lokalisierung in lebenden Zellen zu identifizieren an die Oberfläche. Diese neuen Verfahren beinhalten die Tagging-RNA mittels Spinat 23, SNAP 24 oder MTrip 2. Diese Techniken leiden unter einigen Nachteilen einschließlich der Anforderung, Zellen vor Zugabe von Substraten oder dass eine Einheit konstruiert ist, um die mRNA zu markieren, zu detektieren die mRNA durch Mikroskopie bestimmt werden permeabilisieren. Tatsächlich ist die große ADVAntage von FISH-Analysen in diesem Bericht beschriebenen liegt in der Tatsache, dass die native RNA unverändert ist, die zu den meisten physiologisch relevante Ergebnisse.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 18mm Deckgläsern </td><td> VWR </td><td> 48380 046 </td><td></td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyd </td><td> JT Baker </td><td> S898-07 </td><td> Bis 4% machen: Lösen Sie 20 g in 500 mL 1XDPBS bei 60 ° C mit 5 Tropfen Natronlauge. pH-Wert auf 7,2 vor der Hitze und Lagerung bei -20 ° C. Nicht mehr als 70 ° C! </td></tr><tr><td> Triton-X </td><td> OmniPur </td><td> 9400 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Elute Gel Extraction Kit </td><td> Roche </td><td> D6294-02 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNA Labelling Mix </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> Transkription T7-RNA-Polymerase </td><td> Invitrogen </td><td> 18033-019 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Quick Spin Columns </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Invitrogen </td><td> 18047-019 </td><td></td></tr><tr><td> 1X DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid </td><td> EMD </td><td> FX0420-8 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-021 </td><td></td></tr><tr><td> RNase OUT </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescent Antibody Enhancer Set für DIG-Erkennung # 4 (Blockierungslösung) </td><td> Roche </td><td> 1768506 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor Sekundärantikörper </td><td> Invitrogen </td><td> Siehe Tabelle 2 </td><td></td></tr><tr><td> Hybridisierungsofen </td><td> Sci Boekelschaftliche </td><td> Modell 24100 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroobjekttragerglaschen </td><td> VWR </td><td> 48300-047 </td><td></td></tr><tr><td> Immunomount </td><td> Thermoscientific </td><td> 9990402 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Identifizierung von spezifischen Reagenzien und Ausrüstung <table border="1"><tbody><tr><td> Arten von Anti-DIG-Antikörper (Verdünnung; Unternehmen, Katalog-Nummer) </td><td> Farben </td><td> Alexa Fluor gebrauchten (1:500) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Maus (1:500; Sigma, B7405) </td><td> grün </td><td> Alexa Fluor 488 Esel-anti-Maus (Invitrogen, A21202) </td></tr><tr><td> rot </td><td> Alexa Fluor 594 Esel-anti-Maus (Invitrogen, A21203) </td></tr><tr><td> blau </td><td> Alexa Fluor 647 Esel-anti-Maus (Invitrogen, A31571) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Sheep (1:200; Roche, 11376623) </td><td> grün </td><td> Alexa Fluor 488 Esel-anti-Schaf (Invitrogen, A11015) </td></tr><tr><td> rot </td><td> Alexa Fluor 594 Esel-anti-Schaf (Invitrogen, A11016) </td></tr><tr><td> blau </td><td> Alexa Fluor 647 Esel-anti-Schaf (Invitrogen, A21448) </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Kombinationen von sekundären Antikörpern und Anti-DIG mit Katalognummern und aufgeführten Konzentrationen.

detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)

Viren infizieren die Zellen auszulösen spezifische Änderungen an normalen Zellfunktionen, die Energie und Ressourcen für die virale Replikation ablenken zu dienen. Viele Aspekte der Wirtszelle Funktion von Viren requiriert, üblicherweise durch die Expression von viralen Genprodukten, rekrutieren Wirtszellproteinen und Maschinen. Darüber hinaus, Viren Ingenieur-spezifischen Membran-Organellen oder Schild auf die mobile Vesikel und Motorproteine ​​Regionen der Zelle (während der de novo-Infektion, Viren kooptieren molekularen Motor Proteine ​​in den Kern Ziel gewirkt, später während der Virus Anordnung, werden sie kapern zellulären Maschinen, die in der Montage von Viren helfen wird). Weniger ist, wie Viren, insbesondere solche mit RNA-Genome, koordinieren den intrazellulären Transport von sowohl Protein und RNA-Komponenten und deren Anordnung zu erreichen infektiöser Partikel an bestimmten Orten in der Zelle zu verstehen. Die Untersuchung der RNA Lokalisation begann in früheren Arbeiten. Entwicklung von niederen eukaryotischen emEmbryonen und neuronale Zellen lieferten wichtige biologische Informationen, und auch die Bedeutung von RNA-Lokalisation in der Programmierung der Genexpression Kaskaden. Die Studie in anderen Organismen und Zellsysteme hat ähnlich wichtige Informationen lieferte. Viren sind obligate Parasiten und müssen ihre Wirtszellen zu nutzen, um zu replizieren. Somit ist es wichtig zu verstehen, wie RNA-Viren die RNA-Genome aus dem Kern zu leiten, durch die nukleäre Pore, durch das Cytoplasma und einem seiner endgültigen Bestimmungsort in reifen Viruspartikel 1. FISH dient als nützliches Instrument, um Veränderungen in der Steady-State-Lokalisierung von viraler RNA zu identifizieren. Wenn sie mit Immunfluoreszenz (IF) Analyse 22, FISH / IF Co-Analysen werden Informationen über die Co-Lokalisation von Proteinen liefern mit der viralen RNA-3 kombiniert. Diese Analyse ist somit ein guter Ausgangspunkt, um für die RNA-Protein-Wechselwirkungen mit anderen biochemischen oder biophysikalischen testenTests 4,5, da die Co-Lokalisierung allein ist nicht genug Beweise sicher zu sein, von einer Wechselwirkung. Bei der Untersuchung viraler RNA-Lokalisierung mit einem Verfahren wie diesem, hat eine Fülle von Informationen auf beiden viralen und zellulären RNA Menschenhandel Veranstaltungen 6 gewonnen. Zum Beispiel produziert HIV-1 RNA in den Zellkern der infizierten Zellen, aber die RNA nur in dem Cytoplasma übersetzt. Wenn eine Taste virales Protein fehlt (Rev) 7 hat FISH der viralen RNA zeigte, dass der Block die virale Replikation durch die Beibehaltung der genomischen HIV-1 RNA im Kern 8 ist. Hier stellen wir die Methode für die visuelle Analyse der viralen genomischen RNA in situ. Das Verfahren ermöglicht die Verwendung eines markierten RNA-Sonde. Diese Sonde ist so konzipiert, dass komplementär zu den viralen genomischen RNA. Während der in vitro-Synthese von Antisense-RNA-Sonde, die das Ribonukleotid mit Digoxigenin (DIG) modifiziert wird in einem in vitro transcr enthalteniption Reaktion. Sobald die Sonde an die Ziel-mRNA in Zellen hybridisiert hat, werden nachfolgende Schritte Antikörpermarkierung (1) zeigen die Lokalisation der mRNA als auch Proteine ​​von Interesse bei der Durchführung FISH / IF.

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Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Ein Fluoreszenz-<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)-Methode wurde entwickelt, um visuell Nachweis der viralen genomischen RNA mittels Fluoreszenzmikroskopie. Eine Sonde mit Spezifität zu der viralen RNA, die dann identifiziert unter Verwendung einer Kombination der Hybridisierung und Immunfluoreszenz-Techniken gemacht werden können. Diese Technik bietet den Vorteil der Identifizierung der Lokalisation der viralen RNA oder DNA im Steady-State, Bereitstellung von Informationen über die Kontrolle der intrazellulären Virus Menschenhandel Veranstaltungen.

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

detection-of-viral-rna-by-fluorescence-in-situ-hybridization-fish

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

38.4K Aufrufe.  Sir Mortimer B. Davis Jewish General Hospital. Ein Fluoreszenz- In-situ- Hybridisierung (FISH)-Methode wurde entwickelt, um visuell Nachweis der viralen genomischen RNA mittels Fluoreszenzmikroskopie. Eine Sonde mit Spezifität zu der viralen RNA, die dann identifiziert unter Verwendung einer Kombination der Hybridisierung und Immunfluoreszenz-Techniken gemacht werden können. Diese Technik bietet den Vorteil der Identifizierung der Lokalisation der viralen RNA oder DNA im Steady-State, Bereitstellung v...

Serie: Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH)-Protokoll in menschlichen Spermien

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Forschung

Biologie

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung in whole mount Embryonen und Histologie für Marine Elasmobranchs Angepasst

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

Kombinierte DNA-RNA-Leuchtstoff<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH) zu X-Chromosom-Inaktivierung in Differenzierte Weiblich embryonalen Stammzellen der Maus Studieren

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell level to detect the spatial dynamics of RNA localization with simultaneous insight into the localization of proteins, epigenetic modifications and other details which can be highlighted by immunofluorescence. X-chromosome inactivation is a paradigm for long non-coding RNA (lncRNA)-mediated gene silencing. X-inactive specific transcript (Xist) lncRNA accumulation (called an Xist cloud) on one of the two X-chromosomes in mammalian females is a critical step to initiate X-chromosome inactivation. Xist RNA directly or indirectly interacts with various chromatin-modifying enzymes and introduces distinct epigenetic landscapes to the inactive X-chromosome (Xi). One known epigenetic hallmark of the Xi is the Histone H3 trimethyl-lysine 27 (H3K27me3) modification. Here, we describe a simple and quick immuno-FISH protocol for detecting Xist RNA using RNA FISH with multiple oligonucleotide probes coupled with immunofluorescence of H3K27me3 to examine the localization of Xist RNA and associated epigenetic modifications. Using oligonucleotide probes results in a shorter incubation time and more sensitive detection of Xist RNA compared to in vitro transcribed RNA probes (riboprobes). This protocol provides a powerful tool for understanding the dynamics of lncRNAs and its associated epigenetic modification, chromatin structure, nuclear organization and transcriptional regulation.

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.

Schnell Fluorescent<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung Protokoll für Xist-RNA in Kombination mit Immunfluoreszenz von Histonmodifikationen in X-Chromosom-Inaktivierung

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA<em&gt; In-situ-</em&gt; Die Hybridisierung an Squashed Chromosomen

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

Nachweis von RNA-bindenden Proteinen durch<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down in Adipocyte Kultur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...