Dieses Protokoll ist bedeutsam, weil es die Untersuchung der Stammzellfunktion in verschiedenen Skelettmuskeln ermöglicht und unser Verständnis darüber vertieft, wie sie zur Homöostase, Regeneration und zum Fortschreiten der Krankheit beitragen. Mit diesem Protokoll können wir zwei Populationen lebender Stammzellen aus bestimmten Muskeln isolieren und untersuchen, wie sie funktionieren. Um mit der Muskelisolierung zu beginnen, sprühen Sie die eingeschläferte Maus mit Ethanol ein und platzieren Sie sie mit dem Bauch nach oben.
Machen Sie mit einer Schere einen 0,5 Zentimeter langen horizontalen Schnitt in die Bauchhaut. Ziehen Sie mit beiden Händen an der Haut, um den Rumpf sowie die unteren Extremitäten bis zu den Hinterbeinen freizulegen. Lokalisieren Sie die Gracilis oder den inneren Oberschenkelmuskel und greifen Sie mit einer gebogenen Pinzette danach und heben Sie den Muskel leicht an.
Machen Sie mit einer Schere einen 0,5 Zentimeter langen Schnitt, um den Gracilis-Muskel herauszuschneiden. Wiederholen Sie den Vorgang am anderen Bein. Schneiden Sie die Faszie mit einem Skalpell durch, indem Sie einen 0,5 Zentimeter langen Schnitt entlang der seitlichen Seite des Schienbeins machen.
Fassen Sie dann die Faszie mit einer gebogenen Pinzette und entfernen Sie sie durch Ziehen, wobei die Sehnen am distalen Ende der Hintergliedmaße freigelegt werden. Als nächstes führen Sie eine gerade Pinzette mit superfeinen Spitzen zwischen die distale Sehne des TA und den EDL-Muskel ein. Trennen Sie die Muskeln, indem Sie die Pinzette in Richtung des proximalen Endes der Muskeln schieben.
Bringen Sie die Pinzette zurück zum distalen Ende und durchtrennen Sie die distale Sehne. Fassen Sie die distale Sehne des TA sanft mit einer gekrümmten Pinzette und heben Sie den Muskel nach oben und über seinen proximalen Ansatz. Um die proximale Sehne vorsichtig zu durchtrennen, schneiden Sie das andere Ende so nah wie möglich an der Befestigung ab und übertragen Sie die TA in eine Petrischale.
Verwenden Sie dann die gerade Pinzette mit superfeinen Spitzen, um unter die distale Sehne der EDL zu gehen und schieben Sie die Pinzette in Richtung des proximalen Endes des Muskels, um die Muskeln voneinander zu trennen. Bringen Sie die Pinzette zurück zum distalen Ende und durchtrennen Sie die distale Sehne, ohne den Muskel zu beschädigen. Heben Sie den Muskel durch sanftes Greifen der distalen Sehne der EDL mit einer gekrümmten Pinzette nach oben und über seinen proximalen Ansatz, um die proximale Sehne vorsichtig so nah wie möglich an seinem Ansatz zu durchtrennen.
Schneiden Sie das andere Ende ab und übertragen Sie den EDL-Muskel in eine Petrischale. Wiederholen Sie den Vorgang für das andere Hinterbein. Verwenden Sie eine gerade Pinzette mit superfeinen Spitzen, um zwischen die Achillessehne und die unteren Hintergliedmaßenknochen zu gelangen.
Schieben Sie die Pinzette in Richtung des proximalen Endes des Muskels, um den Muskel von den Knochen zu trennen. Bringen Sie die Pinzette zurück zum distalen Ende und durchtrennen Sie die distale Sehne. Ziehen Sie den Gastrocnemius- oder GA-Muskel nach oben und über das Wadenbein.
Zur Lokalisierung der proximalen Soleussehne. Führen Sie die gerade Pinzette zwischen den Soleus- und GA-Muskeln ein und bewegen Sie die Pinzette in Richtung des distalen Endes der Muskeln, um den Soleus vom GA zu trennen. Trennen Sie nun die proximale Soleussehne. Fassen Sie es mit einer gebogenen Pinzette und heben Sie den Sous vorsichtig an, um Zugang zu seiner distalen Sehne zu erhalten.
Schneiden Sie die distale Sehne durch, um den Soleus vom GA zu isolieren, und legen Sie den Soleus in die Petrischale mit dem Waschmedium. Schneiden Sie dann die GA und legen Sie sie in die Petrischale. Um den Trizepsmuskel zu isolieren, verwenden Sie eine gerade Pinzette mit superfeinen Spitzen, um zwischen den Trizeps und den Oberarmknochen zu gelangen, und schieben Sie die Pinzette in Richtung des proximalen Endes des Muskels, um den Muskel vom Knochen zu trennen.
Schneiden Sie als Nächstes das distale Ende des Trizepsmuskels ab und ziehen Sie es mit einer gebogenen Pinzette nach oben und über den Ellbogen, um an die proximale Sehne zu gelangen. Durchtrennen Sie die proximale Sehne des Trizeps und übertragen Sie den Muskel in eine Petrischale. Wiederholen Sie den Vorgang für die anderen vier Gliedmaßen.
Um das Fell und die Haut vom Kiefer zu entfernen, machen Sie mit einer Schere einen 0,5 Zentimeter langen Schnitt unterhalb des Auges und schneiden Sie in kaudaler Richtung. Drücken Sie dann mit den Daumen und Zeigefingern beider Hände auf jede Seite des Einschnitts und entfernen Sie die Haut, indem Sie sie nach oben und unten ziehen. Lokalisieren Sie die Hauptsehne des Masseters auf der kaudalen Seite unterhalb des Auges und führen Sie die flache Skalpellklinge zwischen Knochen und Muskel ein, um die Sehne zu durchtrennen.
Fassen Sie die Hauptkausehne mit einer gekrümmten Pinzette und schneiden Sie sie mit einer Skalpellklinge oder einer Schere in rostraler Richtung durch, um den Kaumuskel vom Kieferknochen zu trennen. Legen Sie den isolierten Massetermuskel in die Petrischale und wiederholen Sie den Vorgang für den zweiten Massetermuskel. Machen Sie mit einer Schere eine Thorakotomie in der Mitte des Brustbeins und schneiden Sie das Brustbein durch.
Legen Sie die Membran frei, indem Sie 360 Grad durch den Brustkorb schneiden. Um dann den Oberkörper vom Bauch zu trennen, schneiden Sie mit einer Schere durch die Luftröhre, die Speiseröhre, die Hohlvene und die Bauchschlagader. Führen Sie dann mit einer Schere eine Laparotomie einen Zentimeter unterhalb des Brustbeins durch und machen Sie einen Schnitt um 360 Grad.
Legen Sie die geschlossene Schere zwischen Brustkorb und Bauchorgane und drücken Sie sie nach unten. Ziehen Sie vorsichtig am Brustkorb, um ihn von den Bauchorganen zu trennen. Um die Membran vom Brustkorb zu trennen, halten Sie die Membran locker zwischen zwei Fingern und schneiden Sie den Brustkorb mit einer Schere durch.
Schneiden Sie die Membran so nah wie möglich an den Rippen um 360 Grad ab und legen Sie die isolierte Membran in eine Petrischale. Zerkleinern Sie die isolierten Muskeln nacheinander, indem Sie sie in etwa einen Millimeter große Stücke schneiden. Übertragen Sie die gehackten Muskeln in ein konisches 15-Liter-Röhrchen mit fünf Litern Dissoziationspuffer und inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius für 35 Minuten in einem Schüttelwasserbad mit einer Geschwindigkeit von 60 Umdrehungen pro Minute.
Nach enzymatischer Verdauung der gehackten Muskeln wird die Suspension aus dem 15-Milliliter-Röhrchen in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 20-Gauge-Nadel ausgestattet ist, und halten Sie die Probe erneut auf, indem Sie sie fünfmal durch die Nadel auf und ab ziehen. Ziehen Sie die Zellsuspension in die Spritze und seihen Sie die Probe in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen ab, das oben mit einem Zellsieb versehen ist.
Um alle einkernigen Zellen zu entnehmen, waschen Sie das leere konische Röhrchen mit 20 Millilitern Waschmedium und gießen Sie es durch das Sieb, um es mit der abgeseihten Probe zu verbinden. Extrahieren Sie das verbleibende Volumen unter dem Zellsieb mit einer P1000-Pipette. Nach Gewebedissoziation und Antikörperfärbung wurden die Skelettmuskelstammzellen (MuSCs) und fibroadipogenen Vorläuferzellen oder FAPs aus einzelnen Muskeln durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung gereinigt.
Nach dem anfänglichen Gating zur Identifizierung der Zellen und zur Trennung der Sinlets von den Dubletten wurden nachfolgende Gates mit FMO-Kontrollen gesetzt, um die Färbeschwellen zu identifizieren. Die Färbeprobe wurde angesteuert und die SCA1-positive CD31-negative und CD45-negative Population, die den FAPs entsprach, wurde in ein separates Sammelröhrchen sortiert. Die doppelt negative Population wurde weiter gegated, um die VCA-positive Population entsprechend den MuSCs zu sortieren.
Die einzelligen Suspensionen des Zwerchfell- und Trizepsmuskels wiesen im Gegensatz zu den anderen eine höhere relative Häufigkeit von MuSCs auf als FAPs. Die EDU-Färbung war zwar robust, zeigte aber einen Unterschied in den Anteilen der EDU-positiven Zellen für die beiden Stammzelltypen und über die verschiedenen Muskeln hinweg. Für alle Gewebe war der mittlere Anteil der EDU-positiven MuSCs jedoch höher als der der EDU-positiven FAPs.
MuSCs, die aus EDL und GA isoliert wurden, zeigten eine signifikant geringere EDU-Inkorporation im Vergleich zu denen aus TA, Diaphragma, Gracilis oder Trizeps. In ähnlicher Weise wurde eine signifikante Variation in der EDU-Inkorporation auch bei FAPs beobachtet, die aus verschiedenen Muskeln isoliert wurden. Schließlich wurde die Zellreinheit durch Immunfluoreszenzfärbung bestätigt, was auf die Spezifität des Stammzellisolationsprotokolls hinweist.
Der kritischste Schritt ist die mechanische Verdauung des Gewebes. Wenn das Gewebe zu stark geschnitten wird, nimmt die Lebensfähigkeit ab. Wenn das Gewebe zu wenig geschnitten wird, nimmt der EEL ab.
Das Protokoll kann mit Assays kombiniert werden, die das Zellverhalten messen, wie z. B. das Transplantat nach einer Transplantation, um die Stammzellfunktionen in vivo besser zu verstehen. Diese Technik könnte beantworten, ob Unterschiede im Stammzellverhalten innerhalb einzelner Muskeln zu Krankheitsphänotypen und Krankheiten beitragen können, die durch einzigartige Muster betroffener Muskeln gekennzeichnet sind.
