Diese Arbeit wurde von der Paul D. Wellstone Cooperative Research Center (AR052646) unterstützt.

Alle Verfahren wurden überprüft und von der University of Pennsylvania IACUC zugelassen. Ein. EDL Dissection und Vorbereitung (ca. 30 min) <ol><li> Anesthetize Mäusen, um sicherzustellen, dass sie keine Schmerzen oder Leiden während des Verfahrens zu erleben, sondern dass die Muskeln bleiben auch durch die Zirkulation mit Sauerstoff angereichert. Wir verwenden routinemäßig eine Ketamin / Xylazin-Cocktail (100/10 mg / kg) über IP injiziert. Chirurgische Ebene der Anästhesie wird durch die vollständige Abwesenheit von Pedal oder palpedral Rückzug Reflexe, oder das Fehlen von Ohr Zuckungsantwort bestimmt. </li><li> Immobilisieren die Hinterbeine mit einem Pflaster, und entfernen Sie die Haut des unteren vorderen Hinterlauf, um die Muskeln dieses Bereichs aussetzen. Damit die Muskeln feuchte mit der Anwendung der PBS in regelmäßigen Abständen. </li><li> Unter einem Binokular, einen kleinen Einschnitt lateral des Knies, um die Sehne des proximalen EDL Muskel freizulegen. Es gibt zwei Sehnen in dieser Region, und beide sollten geschnitten, um wieder zu aktivierenfernung der EDL. </li><li> Am medialen Knöchels, schneiden die Sehne des TA Muskels, um die distalen Sehnen des EDL, die entlang der meta Tarsalknochen erstrecken freizulegen. Heben Sie den TA Muskel aus dem Weg, man aufpassen, nicht zu schneiden oder berühren Sie die EDL darunter. Zurück zu den distalen Sehnen der EDL, snip jeweils ein und ziehen sie durch die Knöchel, dann greifen die Sehnen, ziehen Sie die EDL weg vom Rest des Körpers. Es sollte aus dem proximalen Ende frei freizugeben, aber wenn nicht, um die laterale Inzision zurückzukehren, um sicherzustellen, dass die Sehne geschnitten ist. Entfernen Sie den Muskel und in einem Seziertisch Gericht mit gekühlten oxygenierten Ringers gefüllt. Merken die Muskeln durch die Sehnen etwa Ruhelänge, die die Länge in vivo gefunden wird. Die Länge ist zu kurz, wenn der Muskel schlaff ist in der Schale, und zu lang, wenn der Muskel auf den sezieren Stifte ziehen wird. </li><li> Euthanize die Maus unmittelbar nach Muskel-Entfernung durch Genickbruch. </li><li> Tie Nähte an den zehndons, so nahe wie möglich an den Muskel, aber nicht berührt den Muskel. Merken die Muskeln etwa Ruhelänge mit den Nähten. </li></ol> 2. Membran-Dissection und Vorbereitung (ca. 30 min) <ol><li> Euthanize die Mäuse vor diesem Verfahren durch Genickbruch unter Anästhesie, wenn die gleiche Maus beiden Sektionen unterworfen ist, oder mit CO 2, gefolgt von der Bestätigung mit Genickbruch. </li><li> Einen Einschnitt in der Haut um den Bauch-und Brusthöhle aussetzen. Öffnen Sie die Bauchhöhle, und schneiden den Körper Wand gerade unterhalb der Rippen. Verwendung Knochen Scheren und ausgehend über der Membran Insertion, um den gesamten Brustkorb nach der Linie der die Rippen geschnitten und Schnitt durch Wirbelsäule. Geschnitten Blutgefäße durch das Zentrum der Membran so daß die Membran leicht entfernt werden kann. </li><li> Entfernen Sie die Membran aus der Maus und in einem Seziertisch Gericht mit Sauerstoff Ringers gefüllt. Vorsichtig geschwenkt, die DIAPhragm in die Schüssel weg zu waschen Blut. Aktualisieren Ringers-Lösung nach Bedarf. </li><li> Schnitt ein schmaler Streifen der Membran von der zentralen Sehne an den Rippen entlang der Ausrichtung der Fasern in dem zentralen Abschnitt der seitlichen hemidiaphragms. Der Streifen sollte zwischen 2-4 mm breit sein. Verwendung Knochen Schere, schnitt die Rippe auf jeder Seite des Streifens, so dass ungefähr 1-2 mm Überhang Rippe auf beiden Seiten der Membran Streifens. </li><li> Tie Nähte an den zentralen Sehne. Nahtmaterial binden an jede der seitlich vorstehenden Rippe endet, und dann binden diese zusammen, um eine große Schleife zu machen. </li><li> Zwei Streifen können aus jedem beliebigen gegebenen Membran (eine von jeder Seite) erhalten werden. </li></ol> 3. Montage Muskeln in der Mechanik Bath <ol><li> Fassen die Nähte und verwenden diese, um die Muskel an einem starren Beitrag befestigen an einem Ende, und an einen Kraftaufnehmer am anderen Ende. </li><li> Passen Sie die Länge, um sicherzustellen, dass die Muskeln nicht schlaff, aber nicht straff. Eine gute Näherung ist die Ruhestätte muscle Länge wie in 1,4 bis 1,5. </li><li> Bad sollte mit oxygeniertem Ringers-Lösung bei 22 ° C gehalten wird, um Muskeln Stabilität zum Testen verlängern gefüllt werden. Muskeln sollte für 5 min in diesem Bad vor der Funktionsprüfung ruhen, so daß Muskeln Temperatur äquilibriert bis 22 ° C. </li></ol> 4. Isometrische Kontraktionen <ol><li> Stellen supramaximale Stimulation AGB. Nach ein Muskel in das Bad eingesetzt wird, verwenden Einzeldosis von 0,5 msec Stimulationsimpulse an ein Zucken zu generieren und zu überwachen Kraftabgabe. Erhöhen Sie aktuelle, bis die Kraft ein Maximum erreicht, aber stabilen Niveau. Erhöhen des aktuellen 10% mehr als dieser Ebene für die restlichen Experimente. </li><li> Stellen Optimale Länge. Mit isometrische twitch Stimulationen, passen Sie die Länge des Muskels allmählich, bis eine maximale Kraft erreicht wird. Seien Sie der Muskel ~ 10 sec zwischen jeder Kontraktion. Optimale Muskel-Länge (L o) wird erreicht, wenn Zuckungskraft maximal ist. Nimm Muskellänge (die Länge seinschen den Muskel-Sehnen-Übergänge für EDL und zwischen dem zentralen Spannglied Muskel-Sehnen-Übergang und dem Muskel Einführen der Rippe) mittels Messschieber. </li><li> Maximale isometrische Tetanic Force. Stimulieren Muskeln an L o gesetzt für einen Zeitraum von 500 ms, mit einer Reihe von 0,5 ms Pulse bei supramaximale Stimulation und Fusion Frequenz (von der Hochebene der Frequenz-Kraft-Beziehung (zB Ref:. 8) Das Plateau für EDL Muskeln typischerweise mit 120 Hz, und für Zwerchfellmuskeln mit 100 Hz erreicht. Stimulieren 3 mal in der jeweiligen Frequenz, mit Ruhezeiten von 5 min Stimulation zwischen Schüben zu jedem Muskel. </li></ol> 5. Exzentrische Kontraktionen <ol><li> Lassen Muskel 5 min zwischen der Durchführung isometrische und exzentrische Kontraktionen ruhen. </li><li> Stimulieren Muskeln isometrisch bei 80 Hz für die ersten 500 ms, von einem 10% L o Dehnung in der letzten 200 ms Stimulation (eine Streckrate von 0,5 L o gefolgt/ Sec). </li><li> Wiederholen Stimulationsmuster mit 5 min Pausen zwischen der gewünschten Anzahl von exzentrischen Kontraktionen. </li><li> Messen Sie Kraft für jeder Kontraktion in der Zeit vor der Zielgeraden. Berechnen Sie den Rückgang der Kraft zwischen dem ersten und letzten Kontraktion. </li></ol> 6. Muscle Entnahme aus dem Apparat <ol><li> Verkürzen Sie die Muskellänge für schonende Entfernung des Muskels vom Wandler zu ermöglichen und posten und schicken Sie es an einem Seziertisch Gericht mit Ringers. </li><li> Entfernen Nahtmaterialien aus den Muskeln. </li><li> Für die EDL Muskel, auslöschen den Muskel zweimal, dann wiegen, bevor die nachfolgende Verarbeitung (z. B. Einfrieren, Befestigung, etc). Dies wird für die Berechnung der Querschnittsfläche und spezifische Kraft wichtig. </li><li> Für das Zwerchfell, in 0,1% Procion Orange, eine Membran impermeante Farbstoff für 15-20 min tränken. Dies stellt einen Index der Dissektion Beschädigungen. </li><li> Sezieren den Muskel vom knöchernen Insertion sowie der Central Sehne. Dies ist notwendig, um ein genaues Gewicht der Muskel bereitzustellen. Blot wie oben vor dem Wiegen und anschließende Vorbereitung. </li><li> Berechnen Querschnittsfläche (CSA): CSA (mm 2) = Masse (mg) / [(L o mm) * (L / L o) * (1,06 mg / mm 3)], wobei L / L o die Faser ist, um Muskeln Längenverhältnis (0,45 für ETL-, 1,0 für die Membran) und 1,06 5 ist die Dichte des Muskels. </li></ol>

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B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mdx+mouse+diaphragm+reproduces+the+degenerative+changes+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature. 352, 536-539 (1991).</li><li>Welch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC124+targets+genetic+disorders+caused+by+nonsense+mutations.">PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations.</a> Nature. 447 (7140), 87-91 (2007).</li></ol>

Produktion und den freien Zugang zu diesem Artikel von Aurora Scientific gesponsert.

Das Ziel dieses Artikels ist es, Leitlinien für die Durchführung isolierten Muskel-Funktion auf zwei Muskeln von Mäusen liefern - die EDL und das Zwerchfell. Die Auswertung dieser Muskeln können Einblick geben, ob oder nicht therapeutischen Kandidaten für Muskelerkrankung nutzbringende bieten. Für beide Muskeln, ist der wichtigste Faktor bei der Beschaffung von robusten Daten eine saubere Präparation. Daher üben und perfektionieren die anfängliche Isolierung Schritt ist, bevor sie auf funktionale Tests unerlässlich. Darüber hinaus Errichtung funktionaler Benchmarks für normalen Muskel ist wichtig, bevor Vergleiche dystrophischen Muskel oder zwischen den Behandlungen. Dadurch wird sichergestellt, dass die Ergebnisse der Studie nicht Gegenstand hohe Variabilität durch die Fähigkeit der Person, die die Experimente vermittelt. Die Verwendung einer Membran impermeante Farbstoff kann mit der Optimierung der Dissektion Vorbereitung helfen, zur Inkubation eines Muskels in einer Lösung, die ein solcher Farbstoff wird am beschädigten Fasern zu markieren, und kann als ein Index d dienenissection Erfolg. Minimieren der Anzahl von Fasern in den Muskel beschädigt wird helfen, die Messung zu optimieren. Die Fasern durch Dissektion beschädigt fluoreszieren viel heller als die durch exzentrische Kontraktion beschädigt, und dann, wenn der Farbstoff auch in der Mechanik verwendet, kann man die Intensität des Farbstoffs zu verwenden, um zwischen den zwei Arten von Schäden zu unterscheiden. Dissektion Membran Streifen wird fast immer Faserschädigung, einfach weil durch Schneiden entlang der Länge der Fasern, einige zwangsläufig zerstört. Farbstoffaufnahme ist stark in denjenigen beschädigten Fasern, und diese werden in der Regel zu den äußeren Kanten der Herstellung beschränkt. Im Durchschnitt beobachten wir ein Band von beschädigten Fasern, die Fasern in drei ~ Breite (~ 120 um) auf beiden Seiten des Muskels Streifen ist. Wenn das beschädigte Band umfasst mehr als 15% des Muskels, dann werden die Daten verworfen. Die Membran Präparation hat auch Belastungen bei der optimalen Größe für funktionelle Maßnahmen. Wir haben gefunden, dass Stücke von diaphragm, die breiter als 5 mm sind beginnt zu falten auf sich selbst, weil die zentrale Sehne Krawatte ist nur an einer Stelle. Dies führt zu einer verminderten spezifischen Kraft in der Zubereitung. Wir haben auch festgestellt, dass schmalere Streifen auch geringere spezifische Kraft, die wir glauben, ist, weil die Zahl der Fasern während der Präparation beschädigt einen größeren Anteil an der gesamten Faser-Nummer enthalten. Wenn beispielsweise 0,1 mm auf jeder Seite beschädigt ist, dann ist das 5% (2x0.1 mm / 4 mm Streifenbreite) des Muskel-Präparat, das nicht beiträgt zu zwingen, während, wenn das Band nur 1 mm, dann 20 % des Muskel-Präparat ist beschädigt. Somit sind sowohl die Breite der beschädigten Region sowie die Breite der gesamten Zubereitung wichtige Faktoren zu steuern. Messungen der maximale isometrische Spannung erfordern, dass alle Muskelfasern in den Muskel stimuliert werden. Weil es enormen Schwankungen in den Komponenten der Vorrichtung in Abhängigkeit muss diese für jeden einzelnen Satz ermittelt werdenbis. Beispielsweise kann Badgröße oder die Art des Stimulators beeinflussen die Intensität der Stimulation. Twitch Stimulation ist ein vernünftiger Weg, um supramaximale Stimulation zu bestimmen. Sobald diese für eine bestimmte Einrichtung und Muskel aufgebaut ist, kann sie für nachfolgende Untersuchungen genutzt werden. Im Gegensatz dazu muss die optimale Länge von jedem gegebenen Muskel für jede Präparation gemessen werden unter Verwendung der iterativen Prozess oben beschrieben. Dadurch wird sichergestellt, dass dicke und dünne Filamente Überlappung optimal ist und die maximal mögliche Kraft Kraftwerksleistung wird gemessen. Alternative Verfahren können auf der Beugungsmuster mit den Muskeln Streifen assoziiert verlassen, aber dies erfordert zusätzliche Ausrüstung hier nicht beschrieben. Wir verwenden routinemäßig 500 ms Stimulation Dauern, die im mittleren Bereich dieses Parameters von anderen Forschern in diesem Bereich verwendet fällt. Obwohl dies einige Ermüdung des Muskels während der Kontraktion bewirken, ist das evidentdurch ein &quot;Absacken&quot; in der maximalen Kraftentwicklung kann diese an sich informativ sein. Zum Beispiel könnte ein Unterschied in Ermüdung durch verschiedene Therapien einschließlich solche, die auf Calcium-Handling, erreicht werden somit die Durchbiegung Kraft während aktive Kontraktion kann als Index für Verbesserungen dienen. Alternativ könnte der Verlust der Kraft anzuzeigen, dass die Fäden auf die Sehnen nicht fest genug, und dass sie sich während der Kontraktion Verrutschen. Der Muskel muss aus dem Bad entfernt werden, und die Nähte müssen neu geknüpft werden, wenn dies auftritt. Wir verwenden auch eine Reihe von 3 tetanische Kontraktionen, die Beurteilung der Stabilität der Zubereitung hilft. Auch hier würde Naht rutscht zum Verlust der Kraft zwischen Kontraktionen führen, erfordern Naht wieder binden. Große Muskeln kann auch erzeugen anoxischen Kerne, welche sich auf Schäden Kraft während das Protokoll führen. Muskelmasse ist ein limitierender Faktor für die Durchführung isolierten Muskel-Funktionstests, wo EDL Muskeln mit Massen größer als 20 mg verlieren Kraft mit jeder Kontraktiontion, und können nicht durch Superfusion in einem Bad unterstützt werden. Membran-Streifen nicht aus den gleichen Komplikationen leiden, weil sie dünn genug, um längere Lebensfähigkeit im Bad haben sind. Andere Muskeln können für isolierte Muskelfunktion, einschließlich des Soleusmuskel, die üblicherweise verwendet wird genutzt werden, aber hier nicht beschrieben. Viele der gleichen Verfahren können nach dem soleus in Bezug auf die Herstellung und die Funktionsprüfung erlassen. Allerdings sind die wichtigsten Unterschiede in der Stimulationsfrequenz und die Parameter für exzentrische Kontraktionen. Die Nutzung der soleus für Funktion ergänzt, dass die beiden anderen Muskeln, und so sollte es als Teil eines &quot;Standard-Paket&quot; für die Beurteilung dystrophischen Mäusen 4, 7 berücksichtigt werden. Exzentrische Kontraktion liefert einen Index von kontraktilen Fragilität, und es ist wichtig, um ein Protokoll zu verwenden, das zu bescheidenen Kraftverlust in den Muskeln aus Wildtyp Tieren und einem signifikanten Verlust an Kraft inunbehandelten dystrophischen Muskeln so, dass es einen breiten dynamischen Bereich für Vergleiche. Ein Fehlen einer Kraftverlust in normalen Muskeln nahe, dass die exzentrische Kontraktion zu mild ist, und wird nicht ausreichend sein, um zwischen Therapien, die nicht wirksam sind und solchen, die wirklich nützlich sind, unterschieden. Allerdings kann ein dramatischer Verlust an Kraft in normalen Muskeln unterworfen exzentrischen Kontraktion zu groß sein, um herauszuarbeiten, Differenzen mit der Krankheit assoziiert sind. Unsere Protokoll für die EDL und Membran verwendet einen 0,5 Lo / sec Streckrate, um eine 10% Längenveränderung erzeugen. Wir führen typischerweise 5 exzentrische Kontraktionen, die zu einem kleinen Verlust von Kraft im normalen Muskeln und einem signifikanten Verlust von Gewalt in dystrophischen Muskeln. Sicherlich können all diese Parameter variiert werden, um die Gesamtlänge Veränderung, die Rate der Strecke oder die Anzahl von exzentrischen Kontraktionen zu erhöhen, um Unterschiede zwischen kranken und gesunden Muskel, sowie auf die Wirkungen einer spezifischen Art der Mutation unterscheiden oder tehandlung ein studiert. Solange es einen deutlichen Unterschied zwischen normalen und erkrankten Muskeln, dann gibt es eine Goldstandard für hinsichtlich der Behandlungen erreicht. Zusammenfassend stellt dieses Protokoll Richtlinien für die Durchführung isometrische und exzentrische Kontraktionen, und hoffentlich werden die möglichen Fallstricke zu vermeiden, wenn die Einstellung dieser Technik in Ihrem Labor.

Muskelfunktion Messungen Beitrag zur Bewertung der potentiellen Behandlungen für Muskelpathologie sowie auf die Bestimmung der physiologischen Mechanismen, die von diesem Gewebe. Bei Muskel-Krankheit, haben die Verwendung von Mausmodellen zu einem zentralen Bestandteil für das Verständnis der Zusammenhänge zwischen Genotyp und Phänotyp, und für die Erweiterung dieses Wissen in die Gestaltung und Prüfung von potenziellen Therapeutika. Die Muskeldystrophien insbesondere haben an Mäusen verlassen, um diese Mittel zu bewerten und zu etablieren präklinische Daten erforderlich, um vorwärts zu bewegen, um Studien an Patienten. Ein häufiges Zielkriterium verwendet isolierten Muskel-Funktion, um Kraft, die für eine breite Palette von Studien ist zu bestimmen. Eine weitere Maßnahme ist die Verwendung von exzentrischen, oder Verlängern, um Kontraktionen bestimmen Veränderungen Muskelmembran Integrität, die defizient ist in Duchenne-Muskeldystrophie, und das Maus-Modell der Krankheit (MDX). Daher ist es für diese Typen von Meßebenen wesentlicheEltern sensibel sein und reproduzierbar. Die Maus extensor digitorum longus (EDL) Muskel wurde ausgiebig für isolierte Muskelfunktion wegen seiner idealen Geometrie und Größe mit einheitlichen Faserorientierung und definitive Sehnen 2, 5, 6, 10, 12 verwendet. Methoden zur EDL Muskeln isometrische funktionelle Messungen wurden in einer früheren JoVE Veröffentlichung 8, sowie in der Treat-NMD SOP 1 beschrieben worden. Wir haben die Beschreibung dieser Methoden, um sowohl isometrische und exzentrische Kontraktionen erweitert. Kennzeichen der Erkrankung sind in der EDL evident, einschließlich heighted Zyklen von Degeneration / Regeneration und verminderte Kraft Ausgang. Die Maus Membran weist die schnellste pathologischen Verlauf der Muskeldystrophie im Vergleich zu anderen Muskeln in der Maus 11. Durch Alter von 6 Monaten umfasst kumulative Fibrose etwa 50% des Muskels. Dies führt zu deutlich impaired Kraftabgabe 11. Daher können therapeutische Wirkstoffe, die fibrotische Infiltration verhindern kann effizient in der Membran ausgewertet werden. Der Verlust von Dystrophin in Muskelzellen führt zu einer erhöhten Brüchigkeit und erhöhten kontraktilen Schäden in allen Muskeln 9. Daher sind viele Therapien für Duchenne-Muskeldystrophie sind für Dystrophin Ersatz ausgerichtet. Als solches ist ein Test, der notwendig geworden ist für die Bewertung dieser Strategien exzentrischen Kontraktion, die zwischen normalen und dystrophischen Muskel unterscheiden kann, sowie zu bestimmen, welchen Nutzen eine bestimmte Strategie zum Schutz eines dystrophischen Muskel von kontraktilen Schäden 2, 3, 4, 12. Dieses Verfahren erfordert entweder eine Dual-Mode-Servomotor, der moduliert / Aufzeichnungslänge und Kraft, oder ein Verfahren zum Anpassen der Länge rasch getrennt von einem Kraftaufnehmer kann.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> in vitro Muscle Test System </td><td> Aurora Scientific </td><td> 1200A </td><td></td></tr><tr><td> Seziermikroskop </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> ACE Lichtquelle </td><td> Schott-Fostec </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Präparierschere </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14060-11 </td><td></td></tr><tr><td> Angled Präparierscheren </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15006-09 </td><td></td></tr><tr><td> Skalpellgriff </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10003-12 </td><td> alternative Dissektionswerkzeug </td></tr><tr><td> Curved Skalpellklingen Nr. 12 </td><td> Fine ScienceWerkzeuge </td><td> 10012-00 </td><td> alternative Dissektionswerkzeug </td></tr><tr><td> Knochen Schere </td><td> Fine Science Tools </td><td> 16044-10 </td><td></td></tr><tr><td> S &amp; T Nahtmaterial Fadenpinzette </td><td> Fine Science Tools </td><td> 00272-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont SS Pinzette - gewinkelt </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11203-25 </td><td></td></tr><tr><td> Braided Seidennaht Größe 6-0 </td><td> Teleflex Medical </td><td> 07-30-10 </td><td></td></tr><tr><td> Medizinisches Band </td><td> Transpore </td><td> 3M </td><td></td></tr><tr><td> Ketaminhydrochlorid 100 mg / ml </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-2051-05 </td><td> Endgültige Dosis beträgt 80 mg / kg </td></tr><tr><td> TranquiVed Injection (Xylazin 100 mg / ml) </td><td> Vedco </td><td> NDC 50989-234-11 </td><td> Endgültige Dosis ist 10 mg / kg </td></tr><tr><td> Reactive orange 14 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-8254 </td><td></td></tr><tr><td> Ringers Solution Components </td><td></td><td></td><td> Lösung ist Gas äquilibriert mit 95% O 2 und 5% CO 2, End-pH 7,4 </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7653 </td><td> Endkonzentration: 118 mM </td></tr><tr><td> Kaliumchlorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217-3 </td><td> Endkonzentration: 4,7 mM </td></tr><tr><td> Calciumchloriddihydrat </td><td> Fisher Scientific </td><td> C79-500 </td><td> Endkonzentration: 2,5 mM </td></tr><tr><td> Monobasischem Kaliumphosphat </td><td> Fisher Scientific </td><td> P-285 </td><td> Endkonzentration: 1,2 mM </td></tr><tr><td> Magnesiumsulfat </td><td> JT Baker </td><td> 2500-01 </td><td> Endkonzentration: 0,57 mM </td></tr><tr><td> 4 - (2-Hydroxyethyl) RohrRazine-1-ethansulfonsäure (HEPES) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td> Endkonzentration: 5,95 g / L </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8270 </td><td> Endkonzentration: 5,5 mM </td></tr></tbody></table>

isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies

Entscheidend für die Bewertung potenzieller Therapeutika für Muskelerkrankung sind empfindlich und reproduzierbare physiologischen Beurteilung der Muskelfunktion. Da viele pre-klinischen Studien am Mausmodell verlassen für diese Krankheiten hat isolierten Muskel-Funktion zu einem der Standards für Go / NoGo Entscheidungen in Bewegung Wirkstoffkandidaten nach vorne in Patienten. Wir zeigen die Herstellung des Extensor digitorum longus (EDL) und Zwerchfell Muskeln für funktionale Tests, die die vorherrschende Muskeln für diese Studien eingesetzt werden. Die ETL-Muskel Geometrie ist ideal für isolierte Muskelpräparate, mit zwei leicht zugänglich Sehnen und einer geringen Größe, die durch Superfusion in einem Bad unterstützt werden können. Die Membran weist tiefe progressive Pathologie in dystrophischen Tiere, und kann als eine Plattform zur Evaluierung viele potenzielle Therapien begegnen Fibrose, und die Förderung myofiber Stabilität dienen. Protokolle für Routineuntersuchungen, einschließlich isometrisch und Exzentric Kontraktionen, werden angezeigt. Isometrische Kraft bietet Beurteilung der Festigkeit und exzentrischen Kontraktionen helfen Sarkolemm Stabilität, welche in vielen Arten von Muskeldystrophien gestört ist auszuwerten. Vergleiche von den erwarteten Ergebnissen zwischen Muskeln aus Wildtyp und dystrophischen Muskeln werden ebenfalls bereitgestellt werden. Diese Maßnahmen ergänzen können morphologische und biochemische Messungen Gewebshomöostase sowie ganze Tier Einschätzungen der Muskelfunktion.

Erwartete Werte für die isometrische Kräfte der EDL Muskeln von 12 Wochen alten Tiere sind in Abbildung 1 dargestellt. Da mdx-Muskeln kompensatorische Hypertrophie aufweisen, können insgesamt tetanische Kraft höher sein mdx Muskel im Vergleich zu gleichaltrigen Wildtyp Kontrollen. Jedoch ist eine weitere geeignete Maßnahme von funktionellen Ausgang spezifische Kraft (Abbildung 2), wobei Kraft Querschnittsfläche normalisiert wird, um diesen Wert zu berechnen. Spezifische Kraft hängt von der inhärenten funktionellen Kapazität des Muskels, wo die Schwäche in dystrophischen Muskeln ist umso offensichtlicher, wenn sowohl absolute Kraft und Querschnittsfläche für bilanziert werden. In unseren Händen, erzeugen EDL Muskeln von mdx-Mäusen etwa 20 - 25% geringere spezifische Kräfte als die der gleichaltrigen Wildtyp-Mäusen 10 bis 26 Wochen alt sind. Für die Membran, ist nur bestimmte Kraft, die für Vergleiche, da die Zubereitung eine Stück des Muskels abhängig vom dissektion. Vergleich der spezifischen Kraft zwischen Wildtyp und mdx Zwerchfellmuskeln spiegelt die progressive Pathologie in diesem Gewebe. Isometrische Kraft nimmt mit dem Alter (Abbildung 3), so dass durch Alter von 6 Monaten, Zwerchfell Muskeln von mdx-Mäusen nicht mehr als die Hälfte der funktionalen Leistung von Membran-Streifen aus gleichaltrigen Wildtyp Kontrollen zu produzieren. Ein Beispiel für die von der Membran exzentrischen Kontraktionen Tests ist in Abbildung 4 dargestellt. Mit jeder weiteren exzentrischen Kontraktion, vermindert Kraftabgabeglied in der Membran Streifen sowohl aus Wildtyp (C57) und mdx-Mäusen. Allerdings ist der Verlust der Kraft dramatischer Probenahme von Muskelgewebe aus der mdx-Maus, vermutlich aus dem Fehlen von Dystrophin und die zugehörigen Proteine. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig1.jpg" /> Abbildung 1. Isometrische tetanische Kraft in Wildtyp und mdx EDL Muskeln f<html> rom 12 Wochen alten Mäusen. Absolute Kraft kann höher sein Alter passende mdx EDL Muskeln durch kompensatorische Hypertrophie. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig2.jpg" /> Abbildung 2. Isometrische tetanische Kraft durch Muskelkraft Querschnittsfläche normiert ist Spezifisch Force, und offenbart niedergedrückt Funktionsfähigkeit EDL Muskeln von mdx Mäusen im Vergleich zu denen von Wildtyp-Mäusen. Spuren sind von den gleichen Mäusen, wie in 1. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig3.jpg" /> Abbildung 3. Der fortschreitende Verlust von Gewalt Erzeugungskapazität von bestimmten Kraft beurteilt wird am deutlichsten in der Membran von mdx-Mäusen (rote Balken) im Vergleich zu Wildtyp (C57 in blaue Linie). 36/50036fig4.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4. Der Verlust der Kraft als Funktion der exzentrischen Kontraktion Nummer für Zwerchfellmuskeln von 12 Wochen alten C57 und mdx Mäusen. Die Daten werden Mittelwert ± SEM für N = 4 Muskeln pro Genotyp.

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Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Muskelfunktion Messungen Beitrag zur Bewertung von potentiellen Therapeutika für Muskelpathologie sowie auf die Bestimmung der physiologischen Mechanismen, die von diesem Gewebe. Wir zeigen die Herstellung des Extensor digitorum longus und Zwerchfell Muskeln für Funktionstests. Protokolle für isometrische und exzentrische Kontraktionen wird gezeigt werden, ebenso wie Unterschiede in den Ergebnissen zwischen dystrophischen Muskeln, die einen pathologischen Zustand, und Wildtyp Muskeln.

Isometrische und exzentrische Krafterzeugung Beurteilung der Skelettmuskulatur Isoliert von Mausmodellen von Muskeldystrophien

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

isometric-eccentric-force-generation-assessment-skeletal-muscles

Research

JoVE Journal

Biology

32.5K Aufrufe.  School of Dental Medicine, University of Pennsylvania. Muskelfunktion Messungen Beitrag zur Bewertung von potentiellen Therapeutika für Muskelpathologie sowie auf die Bestimmung der physiologischen Mechanismen, die von diesem Gewebe. Wir zeigen die Herstellung des Extensor digitorum longus und Zwerchfell Muskeln für Funktionstests. Protokolle für isometrische und exzentrische Kontraktionen wird gezeigt werden, ebenso wie Unterschiede in den Ergebnissen zwischen dystrophischen Muskeln, die einen pathologischen Zustand, und ...

Serie: Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

DNA Transfektion von Säuger Skelettmuskulatur mit In Vivo Elektroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Forschung

Biologie

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

Identifizierung von Zielen für Menschenrechte microRNAs mit dem LightSwitch Luciferase Assay System mit 3&#39;UTR-Reporter-Konstrukte und eine microRNA Mimic in adhärenter Zellen

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

Die Ex vivo Isoliert Skeletal Mikrogefäßdichte Vorbereitung für Untersuchung der vaskulären Reaktivität

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Ex Vivo Beurteilung der Kontraktilität, Müdigkeit und Alternans in isolierten Skelettmuskulatur

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Bewertung von Calcium in Sparks Intact Skelettmuskelfasern

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Tissue Triage und Einfrieren der Modelle von Skelettmuskelerkrankungen

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

Isolieren von Myofibrils von Skelettmuskelbiopsien und Bestimmung der Kontraktilenfunktion mit einem Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been reported that skeletal muscle may increase the extraction of glucose from the blood by up to 50-fold during exercise compared to resting conditions. The increase in muscle glucose uptake during exercise and insulin stimulation is dependent on the translocation of glucose transporter 4 (GLUT4) from intracellular compartments to the muscle cell surface membrane, as well as phosphorylation of glucose to glucose-6-phosphate by hexokinase II. Isolation and incubation of mouse muscles such as m. soleus and m. extensor digitorum longus (EDL) is an appropriate ex vivo model to study the effects of insulin and electrically-induced contraction (a model for exercise) on glucose uptake in mature skeletal muscle. Thus, the ex vivo model permits evaluation of muscle insulin sensitivity and makes it possible to match muscle force production during contraction ensuring uniform recruitment of muscle fibers during measurements of muscle glucose uptake. Moreover, the described model is suitable for pharmacological compound testing that may have an impact on muscle insulin sensitivity or may be of help when trying to delineate the regulatory complexity of skeletal muscle glucose uptake.
Here we describe and provide a detailed protocol on how to measure insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated soleus and EDL muscle preparations from mice using radiolabeled [3H]2-deoxy-D-glucose and [14C]mannitol as an extracellular marker. This allows accurate assessment of glucose uptake in mature skeletal muscle in the absence of confounding factors that may interfere in the intact animal model. In addition, we provide information on metabolic viability of incubated mouse skeletal muscle suggesting that the method&#160;applied possesses some caveats under certain conditions when studying muscle energy metabolism.

Intact regulation of muscle glucose uptake is important for maintaining whole body glucose homeostasis. This protocol presents assessment of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle when delineating the impact of various physiological interventions on whole body glucose metabolism.

Messung der insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten reifen Skelettmuskeln von Mäusen

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

Erzeugung von murinen primären Dickdarmepithel-Monoschichten aus Darmkrypten

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

In Vivo Measurement of Hindlimb Dorsiflexor Isometric Torque from Pig

Reliable assessment of skeletal muscle strength is arguably the most important outcome measure in neuromuscular and musculoskeletal disease and injury studies, particularly when evaluating regenerative therapies&#39; efficacy. Additionally, a critical aspect of translating many regenerative therapies is the demonstration of scalability and effectiveness in a large animal model. Various physiological preparations have been established to evaluate intrinsic muscle function properties in basic science studies, primarily in small animal models. The practices may be categorized as: in vitro (isolated fibers, fiber bundles, or whole muscle), in situ (muscle with intact vascularization and innervation but distal tendon attached to a force transducer), and in vivo (structures of the muscle or muscle unit remain intact). There are strengths and weaknesses to each of these preparations; however, a clear advantage of in vivo strength testing is the ability to perform repeated measurements in the same animal. Herein, the materials and methods to reliably assess isometric torque produced by the hindlimb dorsiflexor muscles in vivo in response to standard peroneal electrical stimulation in anesthetized pigs are presented.

In Vivo Measurement of Hindlimb Dorsiflexor Isometric Torque from Pig

The present protocol describes concise experimental details on the evaluation and interpretation of in vivo torque data obtained via electrical stimulation of the common peroneal nerve in anesthetized pigs.

Im lebenden Organismus Messung des isometrischen Drehmoments des Dorsiflexors der Hintergliedmaßen vom Schwein

Reliable assessment of skeletal muscle strength is arguably the most important outcome measure in neuromuscular and musculoskeletal disease and injury ...