Das Mikroblasenaktivierungs- und -expansionsprotokoll ist von Bedeutung, da es einen großen ungedeckten Bedarf in der Zelltherapieforschung und -herstellung adressiert und die Persistenz und Wirksamkeit von T-Zelltherapien verbessert. Die auf Auftrieb basierende positive Selektions-, Aktivierungs- und Expansionstechnik von Akadeum begrenzt die Überstimulation und die anschließende T-Zell-Erschöpfung während der Aktivierungs- und Expansions-Workflows. Zu Beginn werden 3 mal 10 bis 8 kommerziell erhältliche PBMCs in 2,5 Milliliter Trennpuffer mit biotinyliertem Anti-CD3-Antikörper inkubiert.
Mischen Sie die Komponenten vorsichtig durch Pipettieren und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Fügen Sie den Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers abgestreifte Avidin-Mikrobläschen in einem Verhältnis von 0,5 zu 1 hinzu. Und mischen Sie mit einem handelsüblichen End-over-End-Rotator bei 20 U/min für 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur.
Zentrifuge bei 400 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation befinden sich die positiv selektierten Zellen an der Oberseite der Suspension mit den abgestreiften Avidin-Mikrobläschen, und die verbleibenden nicht selektierten Zellen befinden sich im Zellpellet am Boden des Röhrchens. Führen Sie mit einer neun Zoll großen Glaspipette die Spitze unterhalb der Blasenzellenschicht an den Boden des Röhrchens ein.
Das Zellpellet und den Substand werden mit einer elektronischen Pipette abgesaugt und in ein neues Röhrchen überführt. Resuspendieren Sie die im ursprünglichen Röhrchen verbleibende Blasenzellschicht in einem Milliliter vollständigem T-Zell-Medium. Zentrifugieren Sie den Substand bei 400 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur und verwenden Sie ihn zur indirekten Messung der Reinheit und Rückgewinnung.
Nach dem Zentrifugieren des Substands und der nicht selektierten Zellen wird der Überstand abgesaugt und das Pellet vor dem Zählen in einem Milliliter Medium resuspendiert. Zählen Sie mit Hilfe eines automatisierten Zellzählers die Zellen im Substand mit Hellfeldmikroskopie und bestimmen Sie die Anzahl der in der Blasenzellschicht eingefangenen Zellen, wie im Textmanuskript beschrieben. Um das konjugierte Anti-CD28-isolierte Avidin und die Mikrobläschen zu erzeugen, fügen Sie den biotinylierten Anti-CD28-Antikörper zu den kommerziellen Mikroblasen hinzu und mischen Sie mindestens zwei Stunden lang in End-over-End-Rotation.
Fügen Sie die Anti-CD28-konjugierten Streptokokken-Avidin-Mikroblasen in einem Verhältnis von 1,5 zu 1 zu der vorbereiteten Blasenzellsuspension hinzu. Mischen Sie die Komponenten 15 Minuten lang in einer End-over-End-Rotation. Stellen Sie dann das Gesamtvolumen auf 2 Millionen Zellen pro Milliliter mit vollständigem T-Zell-Medium oder einem anderen gewünschten Medium entsprechend der erhaltenen Zellzahl ein.
Verteilen Sie einen Milliliter aktivierter Zellen in einer 24-Well-Platte und inkubieren Sie in einem befeuchteten 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Nach 24 Stunden fügen Sie IL-2 und lösliches Anti-CD3 hinzu, um eine weitere Expansion zu fördern, wie anhand der anfänglichen Anzahl der am Tag Null plattierten Zellen berechnet. Setzen Sie die Zellplatte wieder in den befeuchteten Kohlendioxid-Inkubator ein und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius.
Entfernen Sie alle zwei Tage die Hälfte des Mediums aus dem Mittelstand. Ersetzen Sie es durch frisches, vollständiges T-Zell-Medium und fügen Sie IL-2 in einer Konzentration von 50 Einheiten pro Milliliter hinzu. Zählen Sie die T-Zellen zweimal wöchentlich, um die Zelldichte zu beurteilen.
Wenn die Zelldichte 2 mal 10 bis 6 oder 2,5 mal 10 bis 6 Zellen pro Milliliter überschreitet, überführen Sie sie in ein größeres Gefäß und verdünnen Sie sie auf 5 mal 10 bis 5 Zellen pro Milliliter. Mischen Sie vorsichtig den Inhalt jeder Vertiefung, indem Sie auf und ab pipettieren. Entfernen Sie den gesamten Inhalt der Vertiefung, einschließlich der Mikrobläschen, und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.
Waschen Sie jede Welle mit 400 Mikrolitern kalziumfreiem und magnesiumfreiem DPBS und geben Sie die Lösung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Zellpellet in 50 Mikroliter Trennpuffer.
Als nächstes teilen Sie 50 Mikroliter Zellsuspension in jeweils 25 Mikroliter zur Aktivierung und Erschöpfung auf. Färben Sie die Zellen mit einem Aktivierungs- und Erschöpfungsantikörper-Färbecocktail und inkubieren Sie sie für 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Fügen Sie einen Milliliter Trennpuffer hinzu, mischen Sie vorsichtig und zentrifugieren Sie, um überschüssige Antikörper auszuwaschen.
Saugen Sie den Überstand vollständig ab. Das Zellpellet wird in einem Milliliter Trennpuffer resuspendiert und in ein geeignetes Gefäß für die Durchflusszytometrie-Analyse überführt. Zwischen der Kontrollprobe und den Zellen, die eine Mikroblasen-Kostimulation erhielten, wurde eine Zunahme der Anzahl lebensfähiger T-Zellen und transgenpositiver T-Zellen beobachtet.
Erhöhte Effektorzellpopulationen wurden auch in den Mikroblasenproben beobachtet. Die lebensfähigen aktivierten T-Zellen exprimieren einen erhöhten Frühaktivierungsmarker CD69 und einen mittleren bis späten Aktivierungsmarker CD25. Die Gesamtzahl und der Prozentsatz der Erschöpfungsmarker PD1-positiver Zellen waren in Zellproben, die eine Mikroblasen-Co-Stimulation erhielten, ebenfalls signifikant höher.
Das richtige Mischen und Dosieren von Mikrobläschen ist unerlässlich, um eine genaue Dosierung zu gewährleisten, da die Mikrobläschen schnell und ohne Bewegung an die Oberfläche schwimmen. Wir gehen davon aus, dass dies ein schnelles Wachstum einer großen Population von T-Zellen mit höherer Aktivität ermöglicht als die erschöpfteren T-Zellen, die bei anderen Methoden häufig beobachtet werden.
