Diese Methode hilft, phänotypische Unterschiede von RP-Zellen über die gesamte menschliche Netzhaut hinweg zu verstehen. Die von Davide Ortolan entwickelte Dissektionstechnik ist sehr reproduzierbar, um eine Ablösung zwischen RP und Netzhaut zu erzeugen. Und die REShAPE-Software ist wirklich bemerkenswert bei der Analyse großer Bilder von RP-Flachhalterungen.
Die Methode, die Davide entwickelt hat, kann verwendet werden, um regionale Unterschiede im RP-Phänotyp von Patienten mit verschiedenen Arten von degenerativen Netzhauterkrankungen zu untersuchen. Schneiden Sie zunächst das konische 50-Milliliter-Röhrchen etwas unter die 5-Milliliter-Marke. Befestigen Sie die Schlauchspitze mit Heißkleber am Boden des Wiegeboots.
Mischen Sie dann die beiden Komponenten des Silikonelastomer-Kits im Verhältnis 10 zu 1, um Lufteinschlüsse zu vermeiden. Gießen Sie die Mischung in das Wiegeboot, das dieses kugelförmige Stück des runden Bodenrohrs enthält. Das Silikon über Nacht bei Raumtemperatur aushärten.
Entfernen Sie das Wiegegefäß und das Rundrohr aus der ausgehärteten Silikonform. Füllen Sie zuerst eine 1-Milliliter-Spritze mit 1700 Millimol D-Mannitol-Lösung und befestigen Sie sie an einer 21-Gauge-Nadel. Führen Sie die Nadel durch die Pars plana ein, um eine Punktion der Vorderkammer des Auges zu vermeiden, und injizieren Sie 400 Mikroliter der Lösung in den Glaskörper.
Lassen Sie das Auge 45 Minuten bei Raumtemperatur. Mit einer feinen Schere und einer Pinzette die Vorderkammer auf Höhe der Pars plana aufschneiden. Füllen Sie die hintere Augenkammer mit kalzium- und magnesiumhaltigem DPBS.
Lokalisieren Sie unter dem Stereomikroskop die Makula, die als gelber Fleck auf der Netzhaut visualisiert wird. Schneiden Sie das Auge in Quadranten, nämlich nasal, temporal, superior und inferior, und stellen Sie sicher, dass die Makularegion erhalten bleibt. Entfernen Sie die Nadeln, wenn sie im Weg sind.
Übertragen Sie den Schmetterling in die hintere Augenkammer in eine 100-Millimeter-Petrischale, die DPBS mit Kalzium und Magnesium enthält. Bevor Sie die Netzhaut entfernen, markieren Sie das Blütenblatt, das die Makula enthält, indem Sie einen V-förmigen Schnitt im Ziliarand machen. Heben und schneiden Sie den gesamten Glaskörper, der auf der Netzhaut liegt.
Schneiden Sie die Netzhaut von den Ziliarändern in allen Blütenblättern ab, um sicherzustellen, dass das RPE nicht zerkratzt wird. Legen Sie das Gewebe in 4% PFA und inkubieren Sie es für eine Stunde. Dreimal mit kalzium- und magnesiumhaltigem DPBS waschen.
Füllen Sie das Gewebe in einen mit dem gleichen Puffer gefüllten Behälter und lagern Sie es bei 4 Grad Celsius. Als nächstes überführen Sie die Probe in eine 100-Millimeter-Petrischale, die DPBS mit Kalzium und Magnesium enthält. Stanzen Sie den Sehnervenkopf mit einem 1,5-Millimeter-Biopsiestempel aus.
Sammeln Sie die Netzhaut und lagern Sie sie im selben Puffer bei 4 Grad Celsius. Um die Sklera aus der RPE-Aderhaut zu entfernen, heben Sie die RPE-Aderhautschicht vorsichtig von der Peripherie ab. Schneiden Sie dann mit einer Vannas-Federschere die Aderhautgefäße und das Bindegewebe ab, die sich zwischen der Sklera und dem RPE befinden.
Nach vollständiger Trennung von der Sklera sammeln Sie die RPE-Aderhautschicht. Das Gewebe in einen mit Kalzium und Magnesium gefüllten Behälter überführen und bei 4 Grad Celsius lagern. Übertragen Sie die RPE-Aderhaut in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte.
Blockieren und permeabilisieren Sie die Probe für eine Stunde bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Probe für eine Stunde bei Raumtemperatur mit Phalloidin, das mit 647-Fluorophor in einer Verdünnung von 1 bis 250 im Permeabilisierungspuffer konjugiert ist. Dreimal in kalzium- und magnesiumhaltigen DPBS waschen.
Übertragen Sie die RPE-Aderhautprobe auf einen 50 x 75 Millimeter großen Glasobjektträger und glätten Sie ihn. Schneiden Sie jedes Blütenblatt in zwei Teile, um die Probe flacher zu machen. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift eine Kontur der flachen Halterung.
Um die Lipofuszin-Autofluoreszenz zu löschen, fügen Sie 500 Mikroliter der Autofluoreszenzlöschlösung hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für zwei Minuten. Gründlich in kalzium- und magnesiumhaltigem DPBS waschen. Entfernen Sie den DPBS und fügen Sie das Einhängemedium hinzu.
Legen Sie ein Deckglas auf die flache Halterung und versiegeln Sie sie mit Nagellack. Öffnen Sie die Software. Wählen Sie auf der Registerkarte "Verzeichnisse" die Eingabe- und Ausgabeordner aus.
Lassen Sie die Software im Ausgabeverzeichnis automatisch den Pfad zum Eingabeverzeichnis oder Prozess ändern. Alternativ können Sie das Ausgabeverzeichnis auch manuell ändern. Um Heatmaps zu erstellen, wählen Sie alle aus dem Dropdown-Menü auf der Registerkarte Farbbilder erstellen.
Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Nein" in der Funktion "Manuelle Grenzwerte verwenden", damit die Software die in jedem Bild erkannten Minimal- und Maximalwerte verwenden kann. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Ja, um den Wertebereich für jede Shape-Metrik-Heatmap manuell anzupassen. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Grenzwerte festlegen und fügen Sie Werte in die Textfelder ein, um Bereiche für die einzelnen Parameter auszuwählen.
Nachdem Sie die gewünschten Werte geändert haben, klicken Sie auf Speichern. Klicken Sie auf niedrige Standardwerte, um alle Grenzwerte zurückzusetzen. Wenn Sie einen Schwellenwert für die Zellengröße in einer niedrigeren Zellengröße auswählen möchten, fügen Sie die Größe der kleinsten Zelle ein, die in die Analyse einbezogen werden soll.
Fügen Sie in die obere Zellengröße die Größe der größten Zelle ein, die eingeschlossen werden soll. Aktivieren Sie unter Konvertieren von Pixeln in reelle Einheiten das Kontrollkästchen Nein, um die Analyse in Pixeleinheiten auszuführen, und aktivieren Sie Ja, um die Analyse in Mikrometern auszuführen. Geben Sie unter Länge der Maßstabsbalkenpixel den Pixelwert in das Textfeld ein.
Geben Sie in Länge des Maßstabsbalkens Mikrometer den entsprechenden Abstand in Mikrometern ein. Um die Analyse zu starten, klicken Sie auf Go. Dieses Protokoll führt zu einem einstufigen Bild einer flachen Halterung, bei dem die Zellposition durch REShAPE-generierte Segmentierung der RPE-Zellgrenzen identifiziert wird.
Außerdem werden 30 Formmetriken, einschließlich der Zellfläche der einzelnen RPE-Zellen, für jede korrekt identifizierte RPE-Zelle gemessen. Schwarze Kacheln, die von Resten der Netzhaut oder anderen hellen Objekten stammen, können entfernt werden, indem Sie eine der Filteroptionen auswählen, die im Dropdown-Menü RT-Filter verfügbar sind. Die Verwendung von RBG-Bildern für die Reshape-Analyse erzeugt vollständig schwarze Binärbilder.
In diesem Fall werden durch die Konvertierung der RGB-Bilder in Graustufen korrekt segmentierte Binärbilder erzeugt. Wenn die Färbung nicht optimal ist oder wenn die Probe durch einen Kratzer beschädigt ist, können große Zellklumpen als eine einzige sehr große Zelle identifiziert werden. In diesem Fall können große Objekte von der Analyse ausgeschlossen werden, indem der Schwellenwert für die Zellengröße geändert wird.
Um ein flaches Gewebe zu erhalten, müssen RP und Aderhaut von der Sklera getrennt werden, auch wenn diese Schritte lange dauern können. Nach der Generierung der RP-Flachhalterung ist es möglich, zusätzliche RPE-Marker zu färben, so dass Sie verschiedene Bereiche der RP-Monoschicht untersuchen können. Mit dieser Methode haben wir fünf verschiedene RP-Populationen entdeckt, die unterschiedlich empfindlich auf verschiedene degenerative Netzhauterkrankungen reagieren.
