Bu yöntem, RP hücrelerinin tüm insan retinasındaki fenotipik farklılıklarını anlamaya yardımcı olur. Davide Ortolan'ın geliştirdiği diseksiyon tekniği, RP ve retina arasında bir dekolmanı oluşturmada oldukça tekrarlanabilir. Ve REShAPE yazılımı, RP düz montajların büyük görüntülerini analiz etmede gerçekten dikkate değerdir.
Davide'in geliştirdiği yöntem, RP fenotipindeki bölgesel farklılıkları farklı retinal dejeneratif hastalıkları olan hastalardan incelemek için kullanılabilir. Başlamak için, 50 mililitrelik konik tüpü 5 mililitrelik işaretin biraz altında kesin. Sıcak tutkal kullanarak tüp ucunu tartım teknesinin dibine takın.
Ardından, silikon elastomer kitinin iki bileşenini 10'a 1 oranında karıştırarak havayı hapsetmekten kaçının. Karışımı, yuvarlak tabanlı tüpün bu küresel parçasını içeren tartım teknesine dökün. Silikonu gece boyunca oda sıcaklığında kürleyin.
Tartım teknesini ve yuvarlak alt boruyu kürlenmiş silikon kalıptan çıkarın. İlk önce, 1 mililitrelik bir şırıngayı 1700 milimol D-Mannitol çözeltisi ile doldurun ve 21 gauge iğneye takın. Gözün ön odasını delmekten kaçınmak için iğneyi pars planadan geçirin ve çözeltinin 400 mikrolitresini vitreusa enjekte edin.
Gözü 45 dakika oda sıcaklığında bırakın. Bir çift ince makas ve forseps kullanarak, ön odayı pars plana seviyesinde kesin. Arka göz odacığını kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS ile doldurun.
Stereo mikroskop altında, retinada sarı bir nokta olarak görselleştirilen makulayı lokalize edin. Maküler bölgenin korunmasını sağlarken gözü kadranlara, yani nazal, zamansal, üstün ve alt kadranlara kesin. İğneleri yoldaysa çıkarın.
Kelebeği gözün arka odasına, kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS içeren 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Retinayı çıkarmadan önce, siliyer kenar boşluğunda V şeklinde bir kesim yaparak makulayı içeren yaprağı işaretleyin. Retina üzerinde yatan tüm vitreusları kaldırın ve kesin.
RPE'yi çizmemek için retinayı tüm yapraklardaki siliyer kenar boşluklarından kesin. Dokuyu% 4 PFA'ya yerleştirin ve bir saat boyunca inkübe edin. Kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS ile üç kez yıkayın.
Dokuyu aynı tamponla doldurulmuş bir kaba aktarın ve 4 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, numuneyi kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS içeren 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Optik sinir kafasını 1,5 milimetrelik bir biyopsi yumrukla delin.
Retinayı toplayın ve aynı tamponda 4 santigrat derecede saklayın. Sklerayı RPE koroidinden çıkarmak için, RPE koroid tabakasını çevreden yavaşça kaldırın. Daha sonra bir çift Vannas Yaylı Makas ile, sklera ve RPE arasındaki koroidal damarları ve bağ dokusunu kesin.
Skleradan tamamen ayrıldıktan sonra, RPE koroid tabakasını toplayın. Dokuyu kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS ile dolu bir kaba aktarın ve 4 santigrat derecede saklayın. RPE koroidini altı delikli bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın.
Numuneyi oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edin ve geçirgenleştirin. Numuneyi, geçirgenlik tamponunda 1 ila 250 seyreltmede 647 florofor ile konjuge edilmiş falloidin ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS'de üç kez yıkayın.
RPE koroid örneğini 50 x 75 milimetrelik bir cam slayda aktarın ve düzleştirin. Numuneyi daha düz hale getirmek için her bir yaprağı ikiye bölün. Hidrofobik bir kalemle düz montajın bir konturunu çizin.
Lipofuscin otofloresansını söndürmek için, 500 mikrolitre otofloresan söndürücü çözeltisi ekleyin ve iki dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS'lerde iyice yıkayın. DPBS'yi çıkarın ve montaj ortamını ekleyin.
Düz montaja bir kapak camı yerleştirin ve oje ile kapatın. Yazılımı açın. Dizinler sekmesinde, giriş ve çıkış klasörlerini seçin.
Çıkış dizininde, yazılımın giriş dizininin veya işleminin yolunu otomatik olarak değiştirmesine izin verin. Alternatif olarak, çıkış dizinini el ile değiştirin. Isı haritaları oluşturmak için, renkli görüntüler oluştur sekmesindeki açılır menüden tümünü seçin.
Yazılımın her görüntüde algılanan minimum ve maksimum değerleri kullanmasına izin vermek için manuel sınırları kullanma özelliğindeki hayır kutusunu işaretleyin. Her şekil metrik ısı haritası için değer aralığını manuel olarak ayarlamak üzere Evet kutusunu işaretleyin. Ardından, sınırları ayarla düğmesine tıklayın ve tek tek parametreler için aralıklar seçmek üzere metin kutularına değerler ekleyin.
İlgilenilen değerleri değiştirdikten sonra, kaydet'e tıklayın. Tüm sınırları sıfırlamak için düşük varsayılanlara tıklayın. Daha düşük hücre boyutunda bir hücre boyutu eşiği seçmek için, analize dahil edilecek en küçük hücrenin boyutunu ekleyin.
Üst hücre boyutunda, dahil edilecek en büyük hücrenin boyutunu ekleyin. Pikselleri gerçek birimlere dönüştürürken, analizi piksel birimlerinde çalıştırmak için hayır'ı, analizi mikrometre cinsinden çalıştırmak için evet'i işaretleyin. Ölçek çubuğu piksellerinin uzunluğu alanına, metin kutusuna piksel değerini girin.
Ölçek çubuğu mikronlarının uzunluğunda, karşılık gelen mesafeyi mikrometre cinsinden girin. Analizi başlatmak için, bunun için git'e basın. Bu protokol, hücre konumunun RPE hücre sınırlarının REShAPE tarafından oluşturulan segmentasyonu ile tanımlandığı düz bir montajın tek düzlemli görüntüsüyle sonuçlanır.
Ayrıca, tek tek RPE hücrelerinin hücre alanı da dahil olmak üzere 30 şekil metriği, doğru tanımlanmış her RPE hücresi için ölçülür. Artık retina parçalarından veya diğer parlak nesnelerden kaynaklanan siyah karolar, RT filtresi açılır menüsünde bulunan filtreleme seçeneklerinden biri seçilerek çıkarılabilir. Yeniden şekillendirme analizi için RBG görüntülerinin kullanılması tamamen siyah ikili görüntüler üretecektir.
Bu durumda, RGB görüntüleri gri tonlamaya dönüştürmek, doğru şekilde bölümlere ayrılmış ikili görüntüler üretecektir. Boyama optimal değilse veya numune bir çizik nedeniyle hasar görmüşse, büyük hücre kümeleri tek bir çok büyük hücre olarak tanımlanabilir. Bu durumda, hücre boyutu eşiği değiştirilerek büyük nesneler analizin dışında bırakılabilir.
Düz bir doku elde etmek için, bu adımlar uzun zaman alabilse bile, RP ve koroidin skleradan ayrılması gerekir. RP düz montajın oluşturulmasını takiben, RP tek katmanının farklı bölgelerini inceleyebilmeniz için ek RPE işaretleyicileri için boyama yapmak mümkündür. Bu yöntemi kullanarak, farklı retinal dejeneratif hastalıklara farklı şekilde duyarlı beş farklı RP popülasyonu keşfettik.
