Wir danken Lab Mitglieder Jeffrey Adijanto, Tina Banzon, Rong Li, Qin Wan, Congxiao Zhang, Jing Zhao, Connie Zhi, Awais Zia, Natalia Strunnikova um Hilfe bei der Charakterisierung dieser Zellkulturen. Besonderer Dank geht an Jing Zhao, Connie Zhi und Tina Banzon für ihre Hilfe bei der Aufrechterhaltung große Bestände von Zellkulturen. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Intramural Research Program unterstützt.

1. Humane, fötale Gewebe Alle menschlichen Gewebe Forschung folgt den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki und der NIH Institutional Review Board. Fetal Augen sind von einem unabhängigen Auftraggeber, Advanced Bioscience Resources (ABR, Alameda, CA) erhalten, aus zufälligen Spender bei 16 bis 22 Wochen der Schwangerschaft, in RPMI-1640 Medium mit Röhren (von ABR) gestellt, auf Eis gepackt, und geliefert von einem über Nacht Priorität Lieferservice. Gewebe lebensfähig bleiben bis zu 48 Stunden nach der Enukleation. 2. Zellkulturmedium MEM-alpha modifiziertes Medium (Sigma-Aldrich) als Basismedium verwendet werden, um 5% vorbereiten und 15% Serum-haltigen Medien für die Kultivierung von RPE-Zellen (RPE Medium; Tabelle 1 unten). <table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Sigma </td><td> Gibco </td><td> Betrag </td><td> Lagerung </td></tr><tr><td> MEM, Alpha-Modifikation </td><td> M-4526 </td><td></td><td> 500 mL </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> N1 ergänzen </td><td> N-6530 </td><td></td><td> 5 mL </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td></td><td> 15140-148 </td><td> 5 mL </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Glutamax - I </td><td></td><td> 35050 </td><td> 5 mL </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Nicht essentielle Aminosäuren </td><td> M-7145 </td><td></td><td> 5 mL </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> THT * </td><td></td><td></td><td></td><td> -80 ° C </td></tr><tr><td> Taurin </td><td> T-0625 </td><td></td><td> 125 mg </td><td></td></tr><tr><td> Hydrocortison </td><td> H-0396 10 </td><td></td><td> 10 ug </td><td></td></tr><tr><td> Triiod-thyronin </td><td> T-5516 </td><td></td><td> 0,0065 pg </td><td></td></tr><tr><td> Rinderfötenserum ** </td><td></td><td></td><td> 5% oder 15% </td><td> -80 ° C </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Humanem fötalen RPE Medium Komponenten zur Darstellung von 500 mL Medium * THT wird durch Auflösen von Taurin-Hydrocortison-Triiod-thyronin in 1 1,5 mL PBS, bevor Sie das Medium aus. Mehrere Aliquots hergestellt und bei -80 ° C bis Kultivierung Vorbereitung des Kulturmediums zu vereinfachen. ** Fötales Rinderserum ist nicht von Sigma-Aldrich oder Gibco erhalten. Rinderfötenserum in Medien Herstellung verwendet wird aus Atlanta Biologicals (Norcross, GA) erhalten. Jede Flasche des Serums hitzeinaktiviertem (56 ° C für 1 Stunde) vor dem Gebrauch. Um sicherzustellen, Zellkultur Konsistenz große Mengen an Serum aus der gleichen Charge gekauft und in -20 ° C bis sie für die Vorbereitung von Medien verwendet werden. Oder 12 - - Well-Platten für ein paar Wochen in Medien mit 20% FBS aus verschiedenen Chargen dünn gesät Zellen aus einer bestimmten Charge von hfRPE Zellen sind in 24 angewachsen. Der am schnellsten wachsende melanated Zellen mit den meisten klassischen RPE Morphologie (Kopfsteinpflaster) deuten auf eine geeignete Serum viel, dass für die Zellkultur eingesetzt werden können. Zellkulturmedium enthält außerdem: N1 Supplement (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / mL, Glutamax / Penicillin-Streptomycin 1:100 mL / mL (Gibco) und essentielle Aminosäure-Lösung (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / mL. Darüber hinaus Hydrocortison (20 ug / L), Taurin (250 mg / L) und Triiod-thyronin (0,013 g / L) (THT) ist vor durch Auflösen dieser drei Komponenten in PBS bis zu einer Endkonzentration von 1:500 vorbereitet (ml / ml). Aliquots von THT sind bei 80 ° C gelagert, bis auf die RPE zugesetzt. 3. Cell Culture Nach Erhalt intakt sind Globen in der Antibiotika-Antimykotikum-Lösung gespült (verdünnt auf 10X;.. Kat.-Nr. 15240-096; Invitrogen) plus Gentamicin (1 mg / mL) für 3 bis 5 Minuten (Abbildung 1 unten). <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Nach der Inkubation Antibiotika off zweimal mit Medium wie HBSS oder PBS gespült. Ein Auge Globus an der Zeit ist, 10 cm Petrischale mit beschichtet mit Sylgard-184 (WPI) übertragen und gesichert mit 27G Nadeln. Mit Clearcut Sideport Messer (Alcon) wird ein Schnitt durch die Lederhaut unter dem Ziliarkörper (3.1 der Entfernung vom Auge Äquator an der vorderen Fläche) hergestellt. Dieser Schnitt wird verwendet, um einen kreisförmigen Schnitt zur Entfernung der vorderen Augenabschnitt zu starten. Dieser Schnitt erfolgt mit einem Wolfram-Karbid beschichtet gebogenen Iris Schere mit einem Messer Wellenschliff (FST). Vor der Entfernung des vorderen Teil des Auges, ist ein Schnitt durch den Glaskörper, um zu verhindern Lösen der retina aus der RPE am hinteren Pol. In 5% Serum enthaltenden Medium für 40-60 Minuten; Nach dem vorderen Teil des Auges entfernt wird, wird der hintere Pol mit Dispase-I-Lösung (.. Roche Diagnostics, Indianapolis, IN 2 U / mL, Kat. Nr. 04942086001) inkubiert in 37 ° C-5% CO 2. Nach Dispase Behandlung werden die hinteren Pole eine HBSS in Petrischalen mit Silikon-Polsterung (Sylgard 184; Dow Corning, Midland, MI) übertragen und seziert in Quadranten oder größere Stücke ausreichend abflachen Gewebe. Dann wird die Netzhaut ist vorsichtig mit einer Pinzette entfernt. Einzel-Zell-RPE-Schichten wurden aus in Blätter geschält und direkt in kaltes Trypsin-EDTA (Gibco, # 25200-056)-Lösung gesammelt. Nach dem RPE erhoben werden, sind Rohre mit Gewebe in Trypsin-EDTA versiegelt und in Wasserbad für 10-15 Minuten bei 37 ° C. Nach 10 Minuten Inkubation werden die Rohre kräftig geschüttelt, um RPE in kleinen Gruppen zu trennen. Wenn die Trennung nicht vollständig ist, werden die Rohre wieder in Wasserbad für weitere 5 Minuten gesetzt. Nach Trypsin-EDTA Inkubation werden die Rohre für möglich un-gelösten gemischt Zellhaufen inspiziert. Jede beobachtete Cluster entfernt werden mit feinen Spitzen Glas Pasteur Pipette. Nach Abzentrifugieren (1,4 Umdrehungen pro Minute auf klinischen Zentrifuge für 4 min), sind hfRPE Zellen in 15% RPE Medien resuspendiert und dann in Flaschen Primaria (Beispiel: Kat.-Nr. 08-772-45; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA.. ). Dieses Medium ist nach 1 Tag mit 5% Serum-haltigen RPE Medium ersetzt, und nachträgliche Änderungen vorgenommen wurden alle 2 bis 3 Tagen. Nach 3 bis 4 Wochen wurde die Zellen konfluent und gleichmäßig pigmentiert. Sie werden dann in 0,25% Trypsin-EDTA für 10 bis 15 Minuten mit Trypsin behandelt, in 15% Serum-haltigen RPE Zellkulturmedium resuspendiert und ausgesät auf klare Zellkultureinsätzen bei 150 bis 200K Zellen pro Well (Transwell; Corning Costar, Corning, NY), mit 12-mm Durchmesser Einsätze, 0,4-um Poren-, Polyester-Membranen (Beispiel: Kat.-Nr. 07-200-161, Fisher Scientific)... Vor der Aussaat wurden die Vertiefungen mit menschlichen extrazellulären Matrix (.. 10 ug in 150 ul HBSS pro Loch, Kat. Nr. 354237; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) beschichtet und gehärtet mit UV-Licht in der Motorhaube für 2 Stunden. In einigen Fällen wurde die Trypsinierung Verfahren für ein zweites Mal wiederholt, um die Zellen, die nicht nach dem ersten Trypsinierung habe lösen zu sammeln. Das gleiche Protokoll (ohne Beschichtung mit ECM) wurde zur Kultivierung von Zellen auf den Flaschen verwendet, um die P1 Population von Zellen zu generieren. Diese Zellen wurden in Experimenten verwendet werden, wenn sie insgesamt Gewebewiderstand von ≥ 200 Ω • cm 2 hatten und gleichmäßig pigmentiert. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/2032fig1full.jpg">Bitte hier klicken für ein größeres Bild 1</a> . 4. Step by Step Procedures <ol><li> Bereiten 12-Well-Platte mit mehreren Lösungen (für jedes Auge 4 Brunnen erforderlich): <ol class="lalpha"><li> add 10x Antibiotika Antimykotika-Lösung - 1 gut / Auge </li><li> add PBS / HBSS-Lösung für Spülen - 2 Brunnen / Auge </li><li> add Dispase-Lösung - 1 gut / Auge </li></ol></li><li> Bereiten Sie sezieren Petrischale mit dem Auspacken 5 Fixierung Nadeln und füllte es mit HBSS </li><li> Entpacken Sie die Augen und legen Sie sie in Antibiotika-Antimykotikum-Lösung für 3-5 Minuten (hergestellt in Schritt 1) </li><li> Spülen Sie die Augen in zwei Brunnen (hergestellt in Schritt 1) ​​mit PBS / HBSS, übertragen Sie sie anschließend zu zerlegen Gericht. </li><li> Trim übermäßigen Muskel-und Bindegewebe um das Auge herum </li><li> Mit 27G Nadeln sichern (Pin auf Silizium-Basis) in den Augen seziert Gericht passen sie in einer Weise, wo Hornhaut nach oben zeigt. </li><li> Mit Sideport Messer machen Schnitt unterhalb Hornhaut, wo Rundschnitt beginnt </li><li> Mit Iris Schere machen um das Auge herum geschnitten, dann mit derselben Schere durch Glaskörper schneiden und heben vorderen Teil des Auges entfernt. Hinweis: in den Schritten 3 bis 8 vermeiden übermäßige mechanische Druck auf Augapfel. </li><li> Transfer offenen Auges in Dispase-Lösung (hergestellt in Schritt 1) </li><li> Inkubieren Augenmuschel für 40-60 Minuten bei 37 ° C mit 5% CO 2 </li><li> Ersetzen HBSS-Lösung in Sezieren Schüssel mit frischem eins. </li><li> Transfer-Auge von Dispase Lösung Sezieren Gericht. </li><li> Position Auge in Petrischale (Augapfel Tasse nach oben) und mit zwei 27G Nadeln. </li><li> Heben teilweise getrennt Netzhaut und mit Retina-Schere Netzhaut weg von den Sehnerv. Discard Netzhaut. </li><li> Mit Iris Schere machen einen Einschnitt von der Peripherie des Auges in Richtung des Sehnervs. </li><li> Mit allen fünf 27G Nadeln flach Auge macht RPE Schicht schön gestreckt. </li><li> Mit der Netzhaut Schere machen kreisförmigen Schnitt um Sehnerv Trennung RPE-Schicht von der Bindung an Sehnerv. Hinweis: Schritte 13-17 können mit geringer Vergrößerung oder ohne Stereo-Mikroskop durchgeführt werden </li><li> Passen Stereomikroskop 250x Vergrößerungoder mehr und finden Rand des RPE Blatt in der Nähe des Sehnervs entlang der Schnittlinie von Iris Schere gemacht. </li><li> Mit zwei Zangen separaten RPE-Bruch-Membran von der Aderhaut Gewebeschicht. Sie kann verlangen, ein paar Versuche, entlang der Kante, wo die Verbindung von RPE und Aderhaut am schwächsten ist zu finden. </li><li> Legen Sie RPE Blatt in kaltes Trypsin-EDTA-Lösung in 15 ml-Röhrchen </li><li> Nach dem RPE, Kappe und Transfer Rohre mit Gewebe in Trypsin-EDTA in Wasserbad für 10-15min gesammelt werden, bei 37 ° C. </li><li> Nach 10 min Inkubation, kräftig schütteln 15 ml Röhrchen RPE in kleinen Gruppen zu trennen. Wenn die Trennung nicht vollständig ist, statt Röhren wieder in Wasserbad für weitere 5 Minuten. </li><li> Überprüfen Sie die Rohre für möglich un-gelösten gemischt Zellhaufen. Jeder beobachtet Clustern sollten entfernt mit feinen Spitzen Glas Pasteurpipette werden. </li><li> Spin down (1,4 Umdrehungen pro Minute auf klinischen Zentrifuge für 4 min) hfRPE Zellen zu entfernen Überstand und resuspendieren Zellen in 15% RPE Medien (9 mL insgesamt) </li><li> Legen Sie 3 ml Zellsuspension in Primaria Flaschen 2 mL frisches 15% RPE Medien, statt Kolben in Inkubator bis zum nächsten Tag (37 ° C, 5% CO 2) </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Funktionelle Validierung von hfRPE Zellkultur In früheren Experimenten haben wir diese primären Kulturen verwendet, um den Ausdruck, Polarisation und Funktion der Plasmamembran Transportproteine ​​ermitteln und die spezifische Signalwege, die RPE-Funktion zu regulieren 1-11 Diese Eigenschaften, wie sie gesammelt sind, stellen eine Validierung von Eigenschaften, die angewendet werden können zu jeder Zelle Generation. Die Experimente im Folgenden zusammengefasst identifizieren die Proteine, die transepithelialen Transport von Flüssigkeiten und die Integrität des parazellulären Weg zu bestimmen. Diese in-vitro-Experimente wurden in einem Tiermodell der Netzhaut wieder Wiederbefestigung 6 wurde bestätigt. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Lokalisierung von CFTR in hfRPE Zellen Left oberen Platte:. CFTR wurde in hfRPE Zellen mit Membran-angereicherten Extrakten nachgewiesen. M, Molekulargewichtsmarker, Spur 1, große reifen (Band C) und unreife (Bänder A und B) Center unten: Immunfluoreszenz Lokalisation von CFTR (grünes Etikett) Top rechte Tafel: vergrößerte Querschnittsansicht durch die z-Ebene zeigen.. Maximum-Intensitäts-Projektion durch die z-Achse. ZO-1 (gekennzeichnet als rot) dient als Tight Junction-Marker Abgrenzung apikalen und basolateralen Seiten des RPE. DAPI (blau) beschriftet die Kerne in der Nähe der Basalmembran. ZO-1 wird als gelb / orange, seit seiner roten Etikett Überschneidungen grüne Fluoreszenz von CFTR. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. IFNy-induzierten physiologischen Veränderungen in hfRPE A:. Zugabe von IFN &amp;ggr; auf die basale Bad erhöhten transepithelialen Transport von Flüssigkeiten (J v) über Monoschicht von primären, kultivierten Zellen hfRPE J v als Funktion der Zeit in der oberen Kurve und Netto-Flüssigkeit aufgetragen. Absorption (apikal basal Bad) ist durch positive Werte angegeben; transepithelialen Potenzial (TEP) und Gesamt-Widerstand des Gewebes (R T) als Funktion der Zeit in der unteren Spuren gezeichnet. B: Zugabe von CFTRinh-172 (5 pM), um die basale Bad hemmte die IFNy-stimulierte J v erhöhen. Unten ist ein Beispiel für Tiermodell Experimente bestätigt hfRPE in vitro-Befunde. In diesem Experiment wurde künstlich geschaffen Netzhautablösung deutlich nach Zugabe von IFNg nach außen Augenoberfläche (Abbildung 4 A, B) reduziert. Dieser Effekt kann teilweise durch blockiert werden: (1) Zugabe von cAMP-Blocker (Abbildung 4D), (2) vollständig nach Zugabe von JAK + cAMP-Blocker blockiert. Bilder unten sind unter Verwendung Oktober Scanner. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. In vivo Netzhautablösung Experimente. Die Verfahren für diese in vivo Experimente wurden bereits im Detail 6 beschrieben. In diesen Experimenten wurden Netzhautablösungen in Ratte Auge durch Injektion von 0,5-3 ul modifizierter PBS-Lösung in den subretinalen Raum (SRS), allein oder mit einer Kombination von JAK-STAT-und PKA-Inhibitoren geschaffen. Jedes Experiment hatte eine erste Kontrolle Zeitraum von 40-70 min nach der Erstellung der Netzhautablösung. Während dieser Zeit war die Änderungsrate der Blase Volumen gemessen, um bleb Stabilität zu gewährleisten. Optische Kohärenz Tomographie (Institut für Angewandte Physik der Russischen Akademie der Wissenschaften, Nischni Nowgorod, Russland) wurde verwendet, um den zeitlichen Verlauf der Änderung der Lautstärke in SRS messen. Der zeitliche Verlauf der re-attachment volume Änderung wurde durch die optische Kohärenztomographie (OCT) gemessen. OCT-Bilder aus 4 verschiedenen Experimenten (Platten auf der linken Seite; AD), dass eine Veränderung in Ablösung Größen zeigen (Pfeile in A, B und D) nach der Zugabe von IFN &amp;ggr; an der vorderen Fläche für 40-70 min. Die Abbildungen A und B zeigen, dass IFNy Jv erhöhte sich von seiner Kontrolle Rate (≈ 2 ul • cm 2 • h -1), um 14 und 12 ul • cm 2 • h-1 bzw.. Nach Zugabe von JAK-STAT Signalweg und PKA-Inhibitoren (C und D), die IFNy - induzierte Absorption lagen deutlich auf 0,2 und 7,9 reduziert ul • cm 2 • h-1 bzw.. Die Pfeile zeigen die Grenze der Blase zum Vergleich mit dem Bereich innerhalb der gestrichelten Linie umgeben, (ab Band). Rechten Seite von Abbildung: top panel-Zusammenfassung der gemessenen Jv Raten von mehreren Experimenten, Mitteltafel-Film ( <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/Bleb%205.wmv">hier klicken</a> ); unteren Panel-3D Abschnitte des Experiments in B. Pseudofarben in blau zusammengefasst zeigt die räumliche Ausdehnung der Ablösung zum Zeitpunkt t = 0 und 40 min nach der Zugabe von INFγ. Alle Tierexperimente wurden in Übereinstimmung mit der Association for Research in Vision and Ophthalmology Aussage durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Animal Care und Verwenden des Ausschusses der National Institutes of Health zugelassen.

<ol>
	<li>Bharti, K., Miller, S. S., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+paradigm:+Retinal+pigment+epithelium+cells+generated+from+embryonic+stem+cells+or+induced+pluripotent+cells.">The new paradigm: Retinal pigment epithelium cells generated from embryonic stem cells or induced pluripotent cells.</a> Pigment Cell &#38; Melanoma Research. , .</li><li>Strunnikova, N. V., Maminishkis, A., Barb, J. J., Wang, F., Zhi, C., Sergeev, Y., Chen, W., Edwards, A. O., Stambolian, D., Abecasis, G., Swaroop, A., Munson, P. J., Miller, S. S., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+and+molecular+signature+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium.</a> Hum Mol Genet. 19 (12), 2468-2486 (2010).</li><li>Miller, S. S., Maminishkis, A., Li, R., Adijanto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+184:+Phototransduction:+RPE+transport+Retina+Phototransduction:+RPE+transport.">Chapter 184: Phototransduction: RPE transport Retina Phototransduction: RPE transport.</a> Encyclopedia of the Eye. , 2540-2540 (2010).</li><li>Bryant, D. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cells+to+organs:+Building+polarized+tissue.">From cells to organs: Building polarized tissue.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (11), 887-901 (2008).</li><li>Maminishkis, A., Chen, S., Jalickee, S., Banzon, T., Shi, G., Wang, F. E., Ehalt, T., Hammer, J. A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).</li><li>Shi, G., Maminishkis, A., Banzon, T., Jalickee, S., Li, R., Hammer, J., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+chemokine+gradients+by+the+retinal+pigment+epithelium.">Control of chemokine gradients by the retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 4620-4630 (2008).</li><li>Economopoulou, M., Hammer, J., Wang, F. E., Fariss, R., Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+localization,+and+function+of+junctional+adhesion+molecule-C+(JAM-C)+in+human+retinal+pigment+epithelium.">Expression, localization, and function of junctional adhesion molecule-C (JAM-C) in human retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (3), 1454-1463 (2008).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Banzon, T., Wan, Q., Jalickee, S., Chen, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN{gamma}+Regulates+Retinal+Pigment+Epithelial+Fluid+Transport.">IFN{gamma} Regulates Retinal Pigment Epithelial Fluid Transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 297, C1452-C1465 (2009).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Wang, F. E., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-C+and+-D+induced+proliferation/migration+of+human+RPE+is+abolished+by+inflammatory+cytokines.">PDGF-C and -D induced proliferation/migration of human RPE is abolished by inflammatory cytokines.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 5722-5732 (2007).</li><li>Maminishkis, A., Jalickee, S., Blaug, S. A., Rymer, J., Yerxa, B. R., Peterson, W. M., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y(2)+receptor+agonist+INS37217+stimulates+RPE+fluid+transport+in+vitro+and+retinal+reattachment+in+rat.">The P2Y(2) receptor agonist INS37217 stimulates RPE fluid transport in vitro and retinal reattachment in rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3555-3566 (2002).</li><li>Wang, F. E., Zhang, C., Maminishkis, A., Dong, L., Zhi, C., Li, R., Zhao, J., Majerciak, V., Gaur, A. B., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-204/211+alters+epithelial+physiology.">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB J. 24, (2010).</li><li>Adijanto, J., Banzon, T., Jalickee, S., Wang, N. S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CO2-induced+ion+and+fluid+transport+in+human+retinal+pigment+epithelium.">CO2-induced ion and fluid transport in human retinal pigment epithelium.</a> J Gen Physiol. 133, 603-622 (2009).</li><li>Li, R., Maminishkis, A., Zahn, G., Vossmeyer, D., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha5beta1+mediates+attachment,+migration,+and+proliferation+in+human+retinal+pigment+epithelium:+relevance+for+proliferative+retinal+disease.">Integrin alpha5beta1 mediates attachment, migration, and proliferation in human retinal pigment epithelium: relevance for proliferative retinal disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5988-5996 (2009).</li><li>Peterson, W. M., Meggyesy, C., Yu, K., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+activates+calcium+signaling,+ion,+and+fluid+transport+in+retinal+pigment+epithelium.">Extracellular ATP activates calcium signaling, ion, and fluid transport in retinal pigment epithelium.</a> J Neurosci. 17, 2324-2337 (1997).</li><li>Voloboueva, L. A., Liu, J., Suh, J. H., Ames, B. N., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R)-alpha-lipoic+acid+protects+retinal+pigment+epithelial+cells+from+oxidative+damage.">R)-alpha-lipoic acid protects retinal pigment epithelial cells from oxidative damage.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 4302-4310 (2005).</li></ol>

In den vorliegenden Experimenten beschreiben wir zusätzliche Änderungen unserer bereits veröffentlichten Techniken 3 ausgelegt, mehrere Schritte notwendig, um konsistente hfRPE primären Kulturen mit einer höheren Anzahl von verfügbaren Zellen pro Auge produzieren zu rationalisieren. Jede Änderung in der ursprünglichen Verfahren wurde rigoros in mehreren Physiologie und Molekularbiologie Experimenten getestet, um sicherzustellen, dass die Änderungen nicht vorstellen Artefakte und wird ständig von vielen anderen Labors die Verwendung dieser Zellen getestet. Schließlich wurden weitere Experimente die In-vitro-Ergebnisse auf ähnliche Störungen vergleichen in Tiermodellen durchgeführt.

Instruments benötigt für die Präparation Protokoll <ol><li> Stereo-Mikroskop - jeder mit arbeiten Vergrößerung x250 für die Präparation benötigt </li><li> Dissecting Gericht - zB Kimble 100 x 20 mm # 23062 (eine pro-Dissektion) jeder beliebigen Quelle </li><li> Sylgard 184 - WPI Cat. # SYLG184 * * Zur Vorbereitung Sezieren Gericht folgen Sylgard 184 enthalten Mischanleitung, pour gemischte Flüssigkeit Elastomer in Petrischale bis 5-8mm bilden. Lassen Elastomer für mindestens 24 Stunden aushärten. Dish mit ausgehärteten Elastomeren kann sterilisiert mit 70% Ethanol und wieder verwendet werden können (~ 100 mal) </li><li> 27 G Nadeln von BD PrecissionGlide 1 ¼ Länge (5 pro Sektion) einer beliebigen Quelle </li><li> HBSS 1X Lösung mit Ca und Mg-Salze - GIBCO Cat # 14025 500ml (gut für mehrere Sektionen). </li><li> Iris Schere Hartmetall Wellenschliff, gebogen - FST Cat # 14559-11 (eins). </li><li> Retinal Schere - Katena Cat # K4-5300 (eins). </li><li> Pinzetten - z. B. Dumont Pinzette # 5 mit polierten Tipps von WPI Cat # 500085 (2 Stück). </li><li> Sideport Messer - Alcon, Clearcut 1mm, Dual Bevel, abgewinkelt Cat # 8065921540. </li><li> Zentrifugenröhrchen 15ml - (einer pro Auge) einer beliebigen Quelle </li><li> Pasteur Glaspipette - (einer pro-Dissektion) jeder beliebigen Quelle </li><li> Die Platte 12 auch (einer pro-Dissektion) jeder beliebigen Quelle </li><li> Primaria 25cm 2-Kolben - (2-3 pro Auge) einer beliebigen Quelle </li></ol>

experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology

Wir haben eine Zellkultur Verfahren, das große Mengen an konfluente Monolayer von primären humanen fötalen retinalen Pigmentepithels (hfRPE) Kulturen mit morphologischen, physiologischen und genetischen Eigenschaften des nativen humanen RPE produzieren kann entwickelt. Diese hfRPE Zellkulturen weisen schwere Pigmentierung und Elektronenmikroskopie zeigen umfangreiche apikalen Membran Mikrovilli. Die junctional Komplexe wurden mit Immunfluoreszenz Kennzeichnung von verschiedenen Tight Junction-Proteine ​​identifiziert. Epitheliale Polarität und Funktion dieser leicht reproduzierbar primären Kulturen ähneln zuvor Säugetieren Modelle von nativen RPE, einschließlich der menschlichen untersucht. Diese Ergebnisse wurden durch die Entwicklung von therapeutischen Interventionen in mehreren Tiermodellen für menschliche Auge Krankheit verlängert. Wir haben uns auf Strategien zur Beseitigung von abnormalen Flüssigkeitsansammlung in der Netzhaut oder subretinalen Raum konzentriert. Die extrazelluläre subretinalen Raum trennt die Photorezeptor äußeren Segmente und der apikalen Membran des RPE und ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Netzhaut-Anhänge und eine ganze Reihe von RPE / Netzhaut-Interaktionen.

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Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Wir bieten eine reproduzierbare Methode zur Kultivierung konfluente Monolayer von menschlichen fetalen retinalen Pigmentepithelzellen (hfRPE) Zellen, die Morphologie, Physiologie, Polarität und Protein-und Genexpression von adulten nativen Gewebe aufweisen. Diese Arbeit hat zu einem Tiermodell verschiedener Augenerkrankungen erweitert worden.

Experimentelle Modelle für das Studium der retinalen Pigmentepithelzellen Physiologie und Pathophysiologie

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

experimental-models-for-study-retinal-pigment-epithelial-physiology

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JoVE Journal

Neuroscience

19.1K Aufrufe.  National Institutes of Health. Wir bieten eine reproduzierbare Methode zur Kultivierung konfluente Monolayer von menschlichen fetalen retinalen Pigmentepithelzellen (hfRPE) Zellen, die Morphologie, Physiologie, Polarität und Protein-und Genexpression von adulten nativen Gewebe aufweisen. Diese Arbeit hat zu einem Tiermodell verschiedener Augenerkrankungen erweitert worden.

Serie: Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Präparation einer Maus Eye für einen ganzen Berg von retinalen Pigmentepithel

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbus-Ansatz-Subretinale Injektion von viralen Vektoren für die Gentherapie bei Mäusen Retinapigmentepithel

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Low-Density Primäre Hippocampus Kultur

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Entwicklung eines raffinierten Protokolls für Trans-skleralen subretinalen Transplantation von menschlichen retinalen Pigment Epithelzellen in Ratte Augen

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for neuroprotection, postconditioning treatments have proven to be promising therapies against cerebral ischemia. However, complicated procedures and potential safety issues limit their clinical application. To overcome these disadvantages, we have developed acidic postconditioning (APC) as a therapy for experimental focal cerebral ischemia. APC refers to the mild acidosis treatment by inhaling CO2 during reperfusion following ischemia. Here we present two models to execute APC in vitro and in vivo, respectively. The oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment of mice and the corticostriatal occlusion and middle cerebral artery occlusion (MCAO) of mice were employed to mimic cerebral ischemia. APC can be simply achieved by transferring brain slices to acidic buffer bubbled with 20% CO2, or by mice inhaling 20% CO2. APC showed significant protective effects against cerebral ischemia, as reflected by tissue viability and brain infarct volume.

Acidic postconditioning protects against cerebral ischemia. Here we present two models to execute APC. They are achieved respectively by transferring corticostriatal slices to acidic buffer after oxygen-glucose deprivation in vitro and by inhaling 20% CO2 after middle cerebral artery occlusion in vivo.

Experimentelle Modelle zur Untersuchung der Neuroprotektion der sauren Nachkonditionierung gegen zerebrale Ischämie

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Vorbereitung von Maus-Retinal-Cryo-Sektionen für die Immunhistochemie

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Charakterisierung und morphologische Dynamik von kultiviertem primärem murinem RPE

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

Autor im Rampenlicht: Effiziente Isolierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen aus adulten Mäusen für die Retinopathie-Forschung

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...