Das übergeordnete Ziel dieser Techniken ist es, die retinale Pathophysiologie im Streptozotocin-induzierten diabetischen Retinopathie-Rattenmodell zu bewerten. Die diabetische Retinopathie ist eine der Hauptursachen für Blindheit. Die kontinuierliche Suche nach pharmakologischen Wirkstoffen mit besserer Wirksamkeit und längerer Wirkung zur Behandlung der diabetischen Retinopathie geht weiter.
Der Prozess der Entdeckung pharmakologischer Wirkstoffe in präklinischen Tiermodellen spielt eine entscheidende Rolle. Diese Tiermodelle helfen, die strukturellen und funktionellen Veränderungen der hinteren Segmentgewebe des Auges zu verstehen. Daher werden wir drei verschiedene Techniken demonstrieren, um diese Veränderungen in den hinteren Segmentproblemen zu untersuchen.
Wir demonstrieren Histologie, um morphologische Veränderungen von Netzhautzellen in Schichten zu untersuchen, BRB-Breakdown-Assay zur Untersuchung von kompromittiertem BRB durch Quantifizierung von ausgetretenem Protein im Glaskörper aus Plasma und auch Fluoreszenzangiographie, um retinale Gefäße mit FITC-Dextran-Farbstoff zu visualisieren. Euthanasieren Sie die Ratte mit einer hohen Dosis von Pentobarbital und bestätigen Sie ihren Tod ohne nachweisbaren Herzschlag. Enukleieren Sie das Auge, indem Sie Einschnitte mit einer Skalpellklinge an den Nasen- und Schläfenregionen des Auges vornehmen.
Schneiden Sie dann entlang der Kanten, um das Auge aus der Orbitalhöhle zu entfernen. Entfernen Sie das überschüssige Fett, das das Auge umgibt, und legen Sie es in 5 ml Fixierlösung. Inkubieren Sie das Auge in fixativer Lösung für 24 bis 48 Stunden.
Entfernen Sie nach der Fixierung das Auge aus der Fixierlösung und geben Sie es in die Petrischale, die mit 10 ml PBS gefüllt ist. Halten Sie mit einer Mikropinzette das Auge mit Sehnerv und machen Sie mit Hilfe einer Mikroschere einen Riegel an Pars plana. Schneiden Sie den gesamten Rand der Hornhaut durch, um die vordere Tasse und die hintere Augenmuschel zu trennen.
Entfernen Sie die Linse und schneiden Sie den Sehnerv ab. Schneiden Sie den hinteren Becher in zwei Hälften und passieren Sie den Sehnerv. Jede Hälfte in die einzelnen Kassetten geben.
Dehydrieren Sie das Gewebe, indem Sie die Konzentration von Ethanol schrittweise von 50% auf 100% Ethanol erhöhen. Und schließlich, klären Sie das Ethanol mit Xylol. Imprägnieren Sie das Gewebe mit vorgewärmtem Paraffin bei 60 Grad Celsius, um Xylol im Gewebe zu ersetzen.
Bereiten Sie die Paraffinblöcke mit einer Stahlform vor, um das Gewebe und die Kassette als Basis zu halten. Während der Vorbereitung des Blocks sollte der optische Scheibenteil des Auges dem Boden der Stahlform zugewandt sein. Füllen Sie die Kassette mit Paraffin und geben Sie sie auf eine kühle Oberfläche.
Befestigen Sie die Klinge und die Kassette auf den jeweiligen Haltern auf Mikrotom. Schneiden Sie mit einem Mikrotom das überschüssige Paraffinwachs ab und schneiden Sie ein Band aus fünf bis sechs Abschnitten mit einer Dicke von 5 Mikrometern. Übertragen Sie das Band auf die Oberfläche des vorgewärmten Wasserbades, um das Band zu entfalten.
Sammeln Sie die Abschnitte auf einem mit Albumin beschichteten Glasobjektträger. Lassen Sie die Rutschen über Nacht bei 37 Grad Celsius trocknen. Um Hämatoxylin und Eosin zu färben, heizen Sie die Objektträger bei 60 Grad Celsius für 1 Stunde vor, um das Paraffin zu schmelzen.
Befolgen Sie das Färbeverfahren, wie es im Manuskript angegeben ist. Beginnen Sie mit der Rehydratation von Gewebe und färben Sie dann mit Hämatoxylin gefolgt von Eosin. Dehydrieren Sie nun das Gewebe und fügen Sie Montagemedium auf die Abschnitte hinzu.
Legen Sie den Deckzettel auf Abschnitte und visualisieren Sie ihn unter dem Lichtmikroskop. Um einen Blut-Netzhaut-Barriere-Abbau-Assay durchzuführen, betäuben Sie die Ratte mit Ketamin und Xylazin und bestätigen Sie den Anästhesiezustand durch Zehenkneipe. Suchen Sie das Herz und führen Sie 1 ml Spritze mit 24-Gauge-Nadel ein, um das Blut durch Herzpunktion zu entnehmen.
Sobald das ausreichende Blut gesammelt ist, geben Sie es in ein EDTA-beschichtetes Rohr. Mischen Sie es vorsichtig, um Hämolyse zu verhindern. Enukleieren Sie das Auge und übertragen Sie es sofort auf Trockeneis.
Beginnen Sie unter gefrorenen Bedingungen mit der Sezierung des Auges durch Entfernung von Hornhaut und Linse. Ziehen Sie den Glaskörper aus dem hinteren Augensegment mit einer Pinzette ohne Kontamination durch die Netzhaut. Übertragen Sie es auf ein homogenisierendes Rohr mit drei bis vier Perlen.
Homogenisieren Sie die Proben mit einem Perlenhomogenisator bei mittlerer Geschwindigkeit für 10 Sekunden. Blut- und Glaskörperproben in Mikrozentrifugenröhrchen zur weiteren Verarbeitung überführen. Zentrifugieren Sie beide Proben bei 5.200 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius.
Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette und fügen Sie 250 Mikroliter Bradford-Reagenz in Vertiefungen hinzu. Verdünnen Sie Glaskörperproben 10 Mal und Plasmaproben 20 Mal mit PBS. Fügen Sie 5 Mikroliter verdünnte Proben zu Bradford-Reagenz hinzu und mischen Sie gut.
Inkubieren Sie die Proben für 20 bis 30 Minuten und messen Sie dann die Absorption bei 590 Nanometern mit einem 96-Well-Plattenleser. Die Intensität der Probe ist direkt proportional zur Proteinkonzentration. Um eine Fluoreszenzangiographie durchzuführen, betäuben Sie die Ratte mit 3% Isofluran und bestätigen Sie den Anästhesiezustand durch Zehenschlag.
Tauchen Sie den Schwanz in warmes Wasser, bevor Sie den Farbstoff injizieren. Injizieren Sie 1 ml 50 mg FITC-Dextran-Lösung pro ml in die laterale Schwanzvene. Lassen Sie den Farbstoff 5 bis 10 Minuten zirkulieren.
Euthanasieren Sie die Ratte mit Pentobarbital und bestätigen Sie ihren Tod ohne nachweisbaren Herzschlag. Enukleieren Sie das Auge und fahren Sie mit der Vorbereitung der flachen Montierung fort. Um die retinale flache Montierung vorzubereiten, legen Sie das Auge auf einen faserfreien Kimwipe und schneiden Sie den vorderen Teil des Auges ab.
Ziehen Sie langsam die Linse, zusammen mit dem Glaskörper, aus dem hinteren Segment des Auges. Übertragen Sie das hintere Segment in eine mit PBS gefüllte Petrischale und schneiden Sie den Sehnerv ab. Platzieren Sie nun die Spitze der spitzen Pinzette zwischen Sklera und Netzhaut.
Bewegen Sie es vorsichtig entlang des Randes der Tasse, um sicherzustellen, dass die Netzhaut zu keinem Zeitpunkt an der Sklera befestigt ist. In der Nähe der optischen Scheibe schneiden, so dass sich die Netzhaut vollständig von der Sklera löst. Sobald bestätigt ist, dass die Netzhaut auf keiner Seite an Sklera befestigt ist, drücken Sie sie langsam in die PBS-Lösung.
Übertragen Sie die Netzhaut mit Hilfe einer Pinzette auf einen sauberen Glasschieber, ohne sie zu beschädigen. Machen Sie mit einer Mikroschere oder einer Skalpellklinge vier Schnitte auf der Netzhaut, wie gezeigt, um sie in vier Quadranten zu unterteilen. Entfernen Sie überschüssiges PBS aus der Netzhautumgebung und fügen Sie Anti-Fading-Montagemedium auf der retinalen flachen Halterung hinzu.
Decken Sie es mit einem Deckglas ab und visualisieren Sie die flache Halterung unter dem konfokalen Mikroskop. Es ist wichtig zu beachten, dass der gesamte Prozess der Fluoreszenzangiographie unter minimalem Licht durchgeführt wird, um das Abschrecken der Fluoreszenz aus FITC-Dextran-Farbstoff zu vermeiden. Bei diabetischen Ratten erleiden die Netzhautzellen eine Degeneration, die zu weiteren Komplikationen führt.
Diese strukturellen Veränderungen können durch Histologietechnik visualisiert werden, um die Zellzahl und -dicke der Netzhaut zu bestimmen. Bei diabetischen Ratten nimmt die Dicke der Netzhautschichten aufgrund von Ödemen zu. Daher hilft diese Technik, verschiedene potenzielle pharmakologische Wirkstoffe zur Behandlung der diabetischen Retinopathie zu untersuchen.
Metabolische Veränderungen in der Netzhaut aufgrund von Diabetes verursachen den Verlust von Perizyten und den Abbau der Blut-Netzhaut-Schranke. Da Protein und andere Biomoleküle in die Netzhaut und den Glaskörper austreten, steigt der Gesamtproteinspiegel im Glaskörper von diabetischen Ratten. Die Verhinderung des Abbaus der Blut-Netzhaut-Schranke könnte das Fortschreiten der diabetischen Retinopathie erheblich behindern.
Bei der diabetischen Retinopathie steigt die Expression des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors, was zur Bildung neuer Gefäße führt. Diese Gefäße stören die normale Netzhautstruktur, und daher ist ihre Innervation von primärer Bedeutung für die Behandlung der diabetischen Retinopathie. Die Fluoreszenzangiographie-Technik wird verwendet, um neue Blutgefäße und auch das Auslaufen von Blutgefäßen zu visualisieren, wie hier hervorgehoben.
Die Angiogenese ist jedoch erst nach sechs bis 12 Monaten Diabetes-Induktion prominent. Diese Technik hilft uns, die Wirkung der medikamentösen Behandlung auf die Innervation der Angiogenese und der vaskulären Leckage zu quantifizieren. Die zukünftige Behandlung der diabetischen Retinopathie erfordert effizientere pharmakologische Wirkstoffe, aber die zukünftigen Behandlungen können nur durch ein besseres Verständnis der Krankheitspathogenese erreicht werden.
Die Beherrschung dieser Techniken könnte den Forschern helfen, die Pathogenese der diabetischen Retinopathie besser zu verstehen, was zu einer Entdeckung besserer pharmakologischer Interventionen führen könnte.
