Die Bedeutung des Protokolls liegt in seiner Bequemlichkeit in der kurzen Zeit, die für seine Fertigstellung benötigt wird. Dies ermöglicht einen hohen Durchsatz, eine hohe Konzentration und einen hohen Grad an Isolierung der gestielten und sessilen Trichomen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Geradlinigkeit.
Bei dieser Technik sollte man die Trichomdichte der Pflanzenquelle berücksichtigen und den Isolationsgrad bei jedem Schritt unter dem Mikroskop überprüfen, während das Protokoll zum ersten Mal durchgeführt wird. Diese Technik wird von Nurit Shalev, einer Cannabis-Expertin vom Volcani Center, demonstriert. Beginnen Sie damit, einen Trockeneisblock mit einem Hammer und einem harten, flachen Gegenstand in einem Fünf-Liter-Plastikbehälter in kleine, feine Flocken zu zerkleinern.
Verwenden Sie ein großes Sieb und sieben Sie die feinen Trockeneisflocken aus dem nicht zerkleinerten Trockeneis in einen weiteren Fünf-Liter-Kunststoffbehälter. Gießen Sie etwa 200 Kubikzentimeter der Trockeneisflocken in einen aufrechten Ein-Liter-Glasbecher. Gib bis zu 10 Gramm gefrorene Cannabis-Sativa-Blütenstände auf die erste Schicht zerkleinertes Trockeneis und bedecke sie mit einer zusätzlichen Schicht von 200 Kubikzentimetern fein zerkleinertem Trockeneis.
Decken Sie dann die Öffnung des Ein-Liter-Glasbechers mit zwei bis drei Schichten eines ein Millimeter großen Moskitonetzes ab und sichern Sie es mit Gummibändern. Gießen Sie als Nächstes flüssigen Stickstoff in einen großen Edelstahlbehälter mit rundem Boden. Setzen Sie ein 350 Mikrometer dickes Sieb in ein Mehlsieb oder Sieb ein, um das Mehlsiebgewebe von unten abzudecken.
Platzieren Sie dieses Mehlsieb über dem großen Edelstahlbehälter mit rundem Boden, der mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist. Um den Verlust der gesiebten Masse zu minimieren, achten Sie darauf, dass die Breite des Behälters die des Mehlsiebs überschreitet. Trennen Sie die Trichome vom Pflanzenmaterial, indem Sie das Ein-Liter-Glas mit der Öffnung nach unten in Richtung des Mehlsiebs schütteln.
Stellen Sie das Becherglas alle zwei bis drei Minuten beiseite, damit das zerkleinerte Trockeneis und das Pflanzenmaterial, das sich auf dem Mehlsieb angesammelt hat, gesiebt werden können. Sieben Sie das Mehlsieb horizontal, um den Durchgang des Pflanzenmaterials in den flüssigen Stickstoff in dem darunter platzierten Edelstahlbehälter mit rundem Boden zu erleichtern. Als nächstes geben Sie flüssigen Stickstoff in den Edelstahlbehälter und das zerkleinerte Trockeneis in den Ein-Liter-Glasbecher, wenn deren Füllstand zur Neige geht.
Wenn das Pflanzenmaterial auf dem Mehlsieb aufgebraucht ist, füllen Sie das gebrauchte Pflanzenmaterial im Glasbecher mit zusätzlichen 10 Gramm frischem Pflanzenmaterial auf und wiederholen Sie den Siebvorgang, bis eine ausreichende Menge angereicherter Trichome im Behälter gesammelt ist. Überprüfen Sie das Vorhandensein einer weißen, pulverartigen Substanz am Boden des Edelstahlbehälters, der in flüssigen Stickstoff getaucht ist, bevor Sie eine mikroskopische Betrachtung durchführen, um die Ansammlung ausreichender Trichome zu bestätigen. Geben Sie eine kleine Menge flüssigen Stickstoff in einen sauberen, kleinen Edelstahlbehälter mit rundem Boden.
Falten Sie dann ein 40 x 40 Zentimeter großes Mikrosieb mit einer Maschenweite von 150 Mikrometern zweimal, um eine 20 x 20 Zentimeter große Falte zu erhalten, und öffnen Sie es kegelförmig. Befestigen Sie den Maschenkegel mit einer oder zwei Wäscheklammern am Rand des Edelstahlbehälters mit rundem Boden, so dass der geöffnete Teil des Kegels aufrecht steht und sein spitzer Teil teilweise in flüssigen Stickstoff getaucht ist. Wenn Sie fertig sind, gießen Sie den flüssigen Stickstoff, der die zuvor erhaltene weiße, pulverartige Substanz enthält, vorsichtig in den Mikrosiebkegel.
Sammeln Sie mit einer breiten Bürste das restliche Pflanzenmaterial aus dem ersten Behälter und geben Sie es in den 150 Mikrometer großen Maschenkegel. Löse als Nächstes vorsichtig die Wäscheklammer vom Deckel des Behälters und öffne den Mikrosiebkegel, um die Trichome in der Mitte des geöffneten Mikrosiebs zu lokalisieren. Halte alle vier Ecken des Mikrosiebs zusammen und tauche den mittleren Teil mit den Trichomen in flüssigen Stickstoff.
Tauchen Sie das Mikrosieb vorsichtig ein und schütteln Sie es eine Minute lang im flüssigen Stickstoff. Machen Sie mit einer sterilen Nadel winzige Löcher in die Kappe eines 50-Milliliter-Reagenzglases, um einen Druckaufbau zu vermeiden. Schaufeln Sie die nicht gesiebten Pflanzenreste, das Trockeneis und die größeren Trichomen, die in der Mitte des Mikrosiebs eingewickelt sind, in ein 50-Milliliter-Reagenzglas und lagern Sie es für die zukünftige Verwendung bei minus 80 Grad Celsius.
Übertragen Sie die gesiebten Trichome, die in den flüssigen Stickstoff getaucht sind, nacheinander durch Mikrosiebe, wobei die Gießgrößen von 105 auf 80 bis 65 und dann auf 50 Mikrometer abnehmen. Sammeln Sie nach jedem Transfer die unterschiedlich großen Trichomen, die auf dem Mikrosieb verbleiben, separat und etikettieren Sie sie. Machen Sie mit einer sterilen Nadel winzige Löcher in die Kappe des Röhrchens.
Übertragen Sie die gewünschten Trichome, die in flüssigen Stickstoff getaucht und in das 50-Mikrometer-Mikrosieb gewickelt sind, mit einem vorgekühlten Löffel auf einen sauberen Teller. Übertragen Sie dann die pulverartigen Trichome mit einem vorgekühlten Spatel schnell in ein beschriftetes, vorgekühltes 1,5-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie die Röhrchen sofort bei minus 80 Grad Celsius für weitere Untersuchungen. In der Anfangsphase des Isolationsprozesses überwogen im isolierten Teil Blattgewebestücke, im Gegensatz zum endgültigen Isolationsprodukt, das vollständig aus nicht kontaminierten isolierten Trichomen bestand.
Die Qualität der isolierten körnigen gestielten und sessilen Trichome wurde im letzten Isolationsschritt beobachtet. Die Reinheit der mit dieser Methode isolierten Trichome war vergleichbar mit einem konventionellen Protokoll. Die zarte Struktur des gestielten Trichomkopfes blieb erhalten, und die gesamten Köpfe des isolierten gestielten Trichoms waren sichtbar, im Gegensatz zur traditionellen Methode, bei der die vollständige Struktur des Trichomkopfes fehlte und nur Bandscheibenzellen vorhanden waren.
Die RNA-Extraktion und die Abschätzung der RNA-Integrität der isolierten Trichome zeigten eine hohe RNA-Integritätszahl oder RIN-Werte von 9,4 bis 10, und die Gelchromatographie zeigte eine hohe RNA-Integrität. Führen Sie vorsichtig die T-Beutel-artige Infusionsbewegung der 150 bis 50 Mikro-Mikrosieb-Isolierung durch. Diese Methode kann Einblicke in die transkriptomische und wahrscheinlich proteomische Zusammensetzung von Trichomen aus Cannabis und Trichomen anderer Pflanzenarten geben.
Im Anschluss an dieses Verfahren können metabolische und transkriptomische Charakterisierungen durchgeführt werden. Diese zusätzlichen Methoden können helfen, die Expressionsniveaus der Gene in den isolierten Trichomen und ihre Stoffwechselprofile zu verstehen. Diese Technik hat die transkriptomische Charakterisierung von Drüsentrichomen aus verschiedenen Cannabissorten ermöglicht.
