Diese Arbeit von einem Norwich Research Park Zugehörigkeit (JR) unterstützt wurde, gewähren die gemeinsame Entwicklung und Physical Sciences Research Council/biotechnologisch und biologische Wissenschaften Research Council BBSRC finanziert OpenPlant synthetische Biologie Forschungszentrum (BB / L014130/1) (M.J.S., U.A.); ein John Innes Centre Wissensaustausch und Vermarktung gewähren (BB/KEC1740/1) (b.b.); und die BBSRC Institut Strategieprogramm Grant "Moleküle aus der Natur" (BB/P012523/1) und John Innes Foundation (U.A.). Wir möchten danken George Lomonossoff für die Bereitstellung der pEAQ-Vektoren und Andrew Davis für die Fotografie.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hoher Durchsatz Vakuum Infiltration kann dieses Protokoll regelmäßig in unserem Labor für die präparative Herstellung von Triterpene Verbindungen des Interesses für verschiedene downstream-Anwendungen verwendet werden. Die hier beschriebenen Vakuum Infiltration Apparat ist leicht repliziert. Zugabe von Vakuum-Speicher ist ratsam, verringern den Zeitaufwand für das notwendige Vakuum ziehen, aber es ist möglich, eine unveränderte Vakuumofen als die Infiltration Kammer einfach wiederverwenden. Zum Schutz der Vakuumpumpe durch Zusatz eines geeigneten Kondensators ist theoretisch sinnvoll, aber in unserem Labor haben wir gefunden, dass dies für unnötig.
Infiltration-Abdeckung ist gefährdet, wenn die Blätter nicht vollständig in der Infiltration Suspension eingetaucht sind. Dieses Problem wird minimiert, indem sichergestellt wird, dass die obere Fläche der pflanzenhalter erreicht das Niveau der Suspension, und dass der pflanzenhalter einen festen Sitz für die Infiltration Bad. Beachten Sie aus Abbildung 2 , dass die obere Fläche der pflanzenhalter in dem Infiltration Bad im Ort eingelassen ist. Dies wird Panels auf die mittleren Kanten des Inhabers bilden den Ankerpunkt am oberen Rand der Infiltration Bad. Die Infiltration Aussetzung erfordert regelmäßige Ergänzungen um die Suspendierung aufrechtzuerhalten. Dies geschieht am besten durch Zugabe von überschüssigen Infiltration Aussetzung, schrittweise Verringerung des OD600 im Laufe einer großen diskontinuierlichen eindringen zu verhindern. Jedoch in unseren Händen scheint Ersatz für Wasser nicht haben eine spürbare Wirkung auf die zu erwartenden Erträge im präparativen Maßstab, obwohl dies nicht quantitativ untersucht wurde. Wie viele Pflanzen aus einer Charge von Infiltration Aussetzung infiltriert werden können, ist noch offen. Wir routinemäßig zwischen 100 und 200 Pflanzen mit einem Batch von Infiltration Aussetzung zu infiltrieren. Darüber hinaus ist es normal, dass etwas Erde in die Infiltration Suspension im Laufe der infiltrationsprozess Leach. Dies wurde nicht gefunden, um eine spürbare Wirkung auf Infiltration Wirksamkeit zu haben.
Während der Ernte ist es ratsam (aber nicht kritisch), nur die Blätter zu ernten, die infiltriert wurden (einige Blätter wachsen nach dem Eindringen). Selektiver Lese verhindert Verdünnung mit unproduktiven Gewebe, die sonst das Verhältnis von endogenen Verunreinigungen im Verhältnis zu der Verbindung von Interesse erhöhen würde. Dies hat einen nominalen Einfluss auf die Leichtigkeit der nachgeschalteten Reinigung und erhöht das Ausmaß dieser Prozesse. Wenn Sie tHMGR verwenden, um Vorläufer Versorgung zu steigern, wird ein necrosed Phänotyp häufig beobachtet, über die Post-Infiltration Wachstumsphase zu entwickeln. Dies ist normal und eigentlich unterstützt selektive Lese und den nachgeschalteten Trocknungsprozess. Das getrocknete Blattpulver kann in der Regel in einem verschlossenen Behälter an einem kühlen, trockenen und dunklen Ort, sondern im Idealfall in einem Exsikkator unter Vakuum gespeichert werden. Dies hängt von der Stabilität der Verbindung von Interesse. Seien Sie vorsichtig, wenn die Wahl in einem-80 ° C Gefrierschrank zu speichern. Sicherstellen, dass die getrockneten Blätter werden in einem wasserdichten Behälter und auf Entfernung aus dem Speicher, ermöglichen diese Container auf Raumtemperatur vor Eröffnung. Nichtbeachtung führt Wiedervernässung der Blätter, Down-Stream-Verarbeitung zu behindern.
Die Schritte nach der Ernte in diesem Protokoll sind für illustrative Zwecke zur Verfügung gestellt und zur Unterstützung jener Forscher, die praktische Chemie begrenzt haben können erleben. Sie können für viele andere Naturprodukt Extraktion/Reinigung Techniken ersetzt werden. Wie in der Einleitung PSE hat viele Vorteile, aber die Kapitalkosten der im Handel erhältlichen PSE-Gerät möglicherweise unerschwinglich und es ist nicht wichtig. Grundlegende Ionenaustausch-Harz-Behandlung ist eine sehr bequeme Methode, traditionelle Verseifung gefolgt von flüssig/flüssig Partitionierung zu ersetzen. Es ist jedoch nicht geeignet für Produkte mit Carbonsäure oder funktionelle Gruppen, die unter Rahmenbedingungen, wie z. B. Ester hydrolysiert werden würde. Diese Produkte dürften auf die grundlegenden Ionenaustauschharz beibehalten werden. Allerdings gibt es potenziellen nutzen dies für eine Aufnahme und Verfahren (hier nicht dokumentiert). Wo traditionelle Verseifung angemessen wäre, dient grundlegende Ionenaustausch-Harz-Behandlung als eine bequeme Alternative. Die beschriebene in Schritt 9, Chromatographie-Methode worden für die Verbindungen, die in Abbildung 3beschriebenen verallgemeinerbare sein gefunden. Verbindungen der erhöhte Polarität können jedoch 100 % Ethylacetat Elution längere erforderlich. Mit Bezug auf Schritt 9.2 nachgeschaltete feine Reinigung ist völlig zusammengesetzte spezifisch und ist auch abhängig von Skala. Wiederholte Runden der kleineren Flash-Chromatographie mit optimierten Steigungen, ist in der Regel ausreichend, um eine Reinheit für NMR-Analyse zu erreichen. In größeren Maßstäben ist Kristallisation oft eine günstige Alternative. In schwierigen Fällen kann abhängig von der gewünschten Menge des isolierten Verbindung präparative oder semi-präparative Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) eingesetzt werden. An anderer Stelle finden Sie einige Beispiele für nachgeschaltete Reinigungsverfahren für eine Reihe von repräsentativen Verbindungen8.
Das aktuelle Protokoll wie hier vorgestellt, wird in unserem Labor routinemäßig verwendet, und Dienstprogramm bewährt hat. Allerdings gibt es noch genügend Spielraum für eine weitere Optimierung der Ausdruck Plattform. In unserem Labor zu untersuchen, wie weitere Weg-Technik wird derzeit gearbeitet und differenzierte Steuerung der Ausdruck proteingehalte könnten Triterpene Produktion weiter, während der Vermittlung Toxizität für Wirtszellen verbessern. Es gibt auch Potenzial zu untersuchen, die Manipulation der intrazellulären Transport Systeme20,21und die Richtung von Enzymen zu verschiedenen zellulären Kompartimenten22,23, Alleen, die verbessert werden könnte die Effizienz der mehrere Oxidation Ereignisse. Nutzenpotenziale für das Ändern der zugrunde liegenden Morphologie der wichtigsten Organellen könnte auch geprüft werden. Zum Beispiel wurde Überexpression des Geschäftsfeldes Membran von Arabidopsis Thaliana HMGR beobachtet, Hypertrophie der dem endoplasmatischen Retikulum in Pflanzen24induzieren; eine wichtige Seite für CYP450-Aktivität. Dieses Protokoll eignet sich ideal für die Herstellung von Milligramm, Gramm-Mengen Triterpene Produkte und kann inmitten der Forschung eingesetzt werden, um Verbindungen für nachgeschaltete Studie (z. B. der systematischen Erforschung von Struktur-Aktivitäts zugreifen Beziehungen und Voruntersuchungen in die pharmakodynamische und Pharmakokinetische Eigenschaften von Bleiverbindungen von klinischen Interesse). Aber die Plattform ist linear zuverlässig skalierbar einfach durch eine Erhöhung der Anzahl der verwendeten Pflanzen und die Praktikabilität der transienten Expression über Agroinfiltration nachgewiesen und im industriellen Maßstab für die Herstellung von Pharmaproteinen 14, so besteht für diese Plattform für kommerzielle Produktion von qualitativ hochwertigen TRITERPENE erweitert werden. Alternativ ist es auch möglich, die Herstellung von stabilen transformanten tragen die abgeschlossene Wunsch multigene biosynthetische Bahn, so dass die Masse Anbau vorstellen und weitere "farming" von transgenen N. Benthamiana Stämme Herstellung von verschiedenen Verbindungen von kommerziellen Wert.

Die TRITERPENE sind eines der größten und die meisten strukturell unterschiedlichen Familien von pflanzlichen Naturprodukten. Trotz ihrer immensen Vielfalt sind alle Triterpene Naturprodukte vermutlich die gleichen linearen Vorläufer 2,3-Oxidosqualene, ein Produkt des Mevalonat-Signalwegs in Anlagen abgeleitet werden. Biosyntheseschritt von 2,3-Oxidosqualene initiiert und gesteuert durch eine Familie von Enzymen Oxidosqualene Cyclases (OSCs) bezeichnet. Dieser biosyntheseschritt Schritt der ersten Ebene der Diversifizierung, mit Hunderten von verschiedenen Triterpene Gerüste von Natur1berichtet worden. Diese Gerüste sind weiter diversifiziert und durch maßgeschneiderte Enzyme, einschließlich aber nicht beschränkt auf, Cytochrom p450s (CYP450s)1,2. Solchen biosynthetischen Bahnen führen zu immensen Komplexität, was manchmal zu Endprodukten, die aus der übergeordneten Triterpene kaum erkennbar sind. Zum Beispiel ist die komplexe Struktur der potenten Insektizide und Antifeedant Limonoid Azadirachtin glaubte, ein Tetracyclic Triterpene Tirucallane Typ3abgeleitet.
Viele Triterpene abgeleitet Naturprodukte, auch solche mit relativ unveränderten Elternteil Gerüste, nachweislich medizinisch relevanten biologischen Aktivität4,5,6,7besitzen. Allerdings hat dieses Potenzial bisher nicht in eine Fülle von Triterpene stammenden Drogen in der Klinik umgesetzt. Dies ist wohl (zumindest teilweise) führen eine Folge der begrenzten praktischen synthetischen Zugang zu dieser Klasse Verbindung, ein Problem, das die Erforschung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen und Entwicklung von ersticken kann Kandidaten durch traditionelle Arzneimittel Chemie-Workflows.
Transiente Expression von Triterpene biosynthetischen Enzymen aus anderen Pflanzenarten in N. Benthamiana Blätter kann endogene Lieferungen von 2,3-Oxidosqualene auf die Herstellung von qualitativ hochwertigen Triterpene Neuheiten (Abbildung 1) umleiten. Dieser Prozess lässt sich funktionell charakterisieren Kandidat Enzyme und die biosynthetischen Bahnen wichtig natürlich vorkommende Stoffwechselprodukte zu rekonstruieren. Ebenso kann es auch ausgenutzt werden kombinatorische biosynthetischen Ansätze, neuartige Triterpene Produkte, eine Strategie zu produzieren, die in den Bibliotheken von strukturell verwandten Analoga, so dass systematische Erforschung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen führen kann biologisch aktive Blei-Verbindungen8,9.
Agroinfiltration ist eine effiziente und einfache Mittel zur Erreichung transiente Expression in N. Benthamiana Blättern. Der Prozess umfasst die Infiltration der Blätter mit einer Suspension von A. Tumefaciens tragen die binären Ausdruck Construct(s) von Interesse. Dies geschieht über die Anwendung von Druck, die Flüssigkeit durch die Stomata, Luft in den interzellularraum verdrängt und ersetzt sie durch A. Tumefaciens Federung zwingt. Die Bakterien übertragen die jeweiligen T-DNA in das Innere der Pflanzenzellen, wodurch lokalisierte und transiente Protein-Expression in den infiltrierten Blattgewebe.
Während alle binären Vektor geeignet für Erzeugung transgene Pflanzen für transiente Expression eingesetzt werden kann, wir nutzen das Cowpea Mosaik Virus CPMV abgeleitet Hypertranslational (HT) Protein Ausdruck System10, 11. in diesem System wird das Gen des Interesses von unübersetzte Regionen (UTR) aus CPMV RNA-2 flankiert. Die 5' UTR enthält Änderungen, was zu sehr hohen Protein-Übersetzung mit keine Abhängigkeit von Virusreplikation12. Diese Technik wurde in der Easy-Quick (pEAQ) binäre Vector Serie entwickelt die ortsspezifische Rekombination Klonen Protokoll-kompatiblen Konstrukte (pEAQ -HT- DEST)10,11umfasst. Die meisten pEAQ Vektoren enthalten auch eine Tomate buschigen Stunt Virus abgeleitet P19 stummschaltungs-Suppressor gen13 innerhalb der T-DNA als Bestandteil der Expressionskassette, umgeht die Notwendigkeit, eine separate P19-tragenden Sorte coinfiltrate und bietet sehr High-Level Protein-Expression in den Host Pflanze Zelle10,11.
Verwendung von N. Benthamiana als ein Ausdruck Host besondere Vorteile hat bei der Arbeit mit Pflanzen biosynthetischen Bahnen. Die Zellarchitektur unterstützt intrinsisch entsprechenden mRNA und Protein-Verarbeitung und ordnungsgemäße Abschottung, neben der notwendigen Coenzyme, Reduktasen (für CYP450s) und metabolischen Grundstoffe. Die Kohlenstoffquelle ist Photosynthese; So können Pflanzen einfach in qualitativ hochwertigem Kompost, erfordern nur Wasser, CO2 (aus der Luft) und Sonnenlicht als Eingänge angebaut werden. Die Plattform ist auch sehr praktisch für Co Ausdruck von verschiedenen Kombinationen von Proteinen, wie dies durch das Co Eindringen verschiedener Stämme von A. Tumefaciens, negiert die Notwendigkeit, große multigene Ausdruck erstellen facilely erreicht werden kann Kassetten. Darüber hinaus kann der Prozess zuverlässig und linear skaliert werden einfach durch Erhöhung der Anzahl der Pflanzen in das Experiment.
Bisherige Arbeit in unserem Labor hat die Nützlichkeit dieser Plattform für präparative Skala Experimente gezeigt. Dazu gehörten die Vorbereitung der neuartigen TRITERPENE für Bioaktivität Assays und Skala bis Gramm-Mengen isoliertes Produkt zu erreichen. Des weiteren Ansammlung von heterogenen Triterpene Produkte gesteigert werden kann mehrere Falten durch Co Ausdruck einer N-Terminal-abgeschnitten, Feedback-unempfindliche Form des 3-hydroxy-, 3-Methyglutary-Coenzym eine Reduktase (tHMGR), eine Bandbreitenbegrenzung vor- Enzym in der Mevalonate Bahn8.
Schlüssel für solche Experimente präparative-Skala ist die Möglichkeit, bequem bis-der Infiltrationsvorgang Skala. In einem typischen Experiment möglicherweise Dutzende bis Hunderte von Pflanzen müssen die Zielmenge isoliertes Produkt zu erreichen. Infiltrieren einzelne Blätter von hand ist (mit einer unnötigen Spritze), operativ anspruchsvoll und oft sehr zeitaufwendig, Rendern diese Methode nicht praktikabel für routinemäßige Scale-Up. Vakuum Infiltration bietet Vorteile gegenüber Hand Infiltration, wie es nicht abhängig von der Spielstärke des Betreibers ist und das Eindringen von einen größeren Bereich der Blattoberfläche ermöglicht. Dieses Verfahren ist für die großtechnische Produktion von Pharmaproteinen14kommerziell genutzt. Dieses Protokoll verwendet eine leicht replizierbar Vakuum Infiltration Vorrichtung, die aus handelsüblichen Teilen konstruiert werden kann. Dies ermöglicht das gleichzeitige Eindringen von bis zu 4 Pflanzen, bieten schnelle und praktische diskontinuierlichen Infiltration von Hunderten von Pflanzen in kurzer Zeit (Abbildung 2a -2 b). Das Vakuum Infiltration Apparatur besteht aus einem Vakuumofen bildet die Infiltration Kammer (Abb. 2f). Der Ofen ist mit einer Pumpe über ein Vakuum-Speicher verbunden. Dies reduziert den Zeitaufwand für das gewünschte Vakuum in der Infiltration Kammer zu erreichen. Pflanzen sind gesichert in einem maßgeschneiderten Halter und in einem 10 L Edelstahl Wasserbad gefüllt mit A. Tumefaciens Federung invertiert (Abbildung 2a -2 c). Vollständiges Eintauchen die oberirdischen Teile der Pflanzen ist wichtig für effiziente Infiltration. Das Wasserbad wird dann innerhalb der Infiltration Kammer platziert (Abb. 2d -2e), und das Vakuum angewendet, um die Luft aus den Zwischenräumen Blatt zu ziehen. Sobald der Druck wurde um 880 Mbar (ein Prozess, der dauert ca. 1 min) reduziert die Infiltration Kammer wird zurückgebracht schnell auf den atmosphärischen Druck über 20-30 s durch Öffnen des Einlassventils Ofen, worauf Infiltration abgeschlossen ist.
Fünf Tage nach Eindringen ist das Pflanzenmaterial bereit für die Ernte und die anschließende Extraktion und Isolierung der gewünschten Produkte. Ab diesem Zeitpunkt ist der Prozess einfach eines Naturprodukt Extraktion und Reinigung von Blattmaterial, einen Workflow, der jeder Naturprodukt Apotheke vertraut ist. Es gibt viele verschiedene Methoden für die erste Extraktion und anschliessende Reinigung15. Die am besten geeignete Wahl der Methoden und die genauen Bedingungen verwendet ist stark abhängig von der besonderen chemischen Eigenschaften der Verbindung von Interesse, neben der Verfügbarkeit von Fähigkeiten und/oder Ausrüstung. Es ist nicht möglich, in diesem Protokoll eine voll verallgemeinerbare, Schritt für Schritt Methode für die Weiterverarbeitung von geernteten Blatt Pflanzenmaterial, isoliertes Produkt enthalten, die für jedes Triterpene Produkt von Interesse Blind gefolgt werden könnte, noch wäre es sollten Sie versuchen, dies zu tun. Jedoch wird dieses Protokoll geben einen Überblick über die grundlegenden Workflow verwendet in unserem Labor und einige Methoden für die frühen Phasen des Prozesses, die nach unserer Erfahrung für die meisten sauerstoffreiches aglykon Triterpene Produkte verallgemeinerbare bewiesen haben. Dazu gehören zwei relativ seltene Techniken, nämlich unter Druck gesetzt Lösungsmittel Extraktion (SPE) und eine bequeme heterogenen Phase Methode für Chlorophyll Entfernung mit einem stark basischen Ionenaustausch-Harz.
PSE ist eine hocheffiziente Technik für die Gewinnung von kleine organische Moleküle aus festen Matrizen. Der Hauptvorteil ist die Fähigkeit, gemilderten Temperaturen zu verwenden, die das Kochen mehr als Punkt des Lösungsmittels Extraktion, Extraktionen sind unter Druck (ca. 100-200 Bar) durchgeführt. Dies reduziert erheblich die Zeit und die Menge des Lösungsmittels erforderlich, um eine vollständige Extraktion zu erreichen, im Vergleich zu anderen heiße Lösungsmittel Techniken wie einfache zurückfließt oder Soxhlet-Extraktion-16. Kommerzielle Benchtop-PSE Instrumente zur Verfügung, die austauschbar Extraktion Zellen und automatisierte Lösungsmittel Umgang mit Heizung und Überwachung nutzen. Dies macht diese Technik sehr bequem. Es ist auch wohl weniger gefährlich, besonders für Betreiber mit begrenzten praktischen Chemie Erfahrung.
Verseifung von groben Blatt-Extrakten unter Rückfluss gefolgt von flüssig/flüssig Partitionierung ist ein verbreitetes Verfahren für die Bulk-Entfernung von Chlorophylle vor nachfolgende Reinigung oder Analyse. Jedoch kann dies oft operativ in größeren Maßstäben anspruchsvoll sein. Darüber hinaus kann die Erkennung der Schnittstelle oder Produktverlust durch die Bildung von Emulsionen problematisch sein. Die Verwendung von stark basischen Ionenaustauscher heterogenen Phase Hydrolyse durchführen kann als eine bequeme Alternative dienen. Die pigmentierte Portion hydrolysiertes Chlorophyll bleibt das Harz eingehalten und kann einfach durch Filtration entfernt werden. Dieses Protokoll nutzt eine präparative Skala Anpassung einer bereits gemeldeten analytische Verfahren17 , die einem im Handel erhältlichen grundlegende Ionenaustauschharz beschäftigt.
Nachfolgend beschreiben wir eine detaillierte und schnelle Protokoll für die präparative Produktion der TRITERPENE, die Verwendung dieser pflanzlichen Plattform. Dieses Protokoll wird in unserem Labor routinemäßig verwendet, um vorzubereiten Dutzende bis Hunderte von Milligramm isolierten Triterpene Produkt für Anwendungen eine strukturelle Charakterisierung von Kernresonanzspektroskopie (NMR) und/oder weiter zu studieren in funktionalen Assays.

<table><tbody><tr><td>GC-MS instrument</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler suitable for performing PCR reactions</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 100 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, and 2 &amp;micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/&gt; 15000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/&gt; 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/&gt; 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Standing incubator</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge bottles (1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum infiltration apparatus</td><td>bespoke</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>9 x 9 cm plant pots</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Freeze drying apparatus (=/&gt; 8 litre condenser capacity)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument)</td><td>Buchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Spatulas (assorted sizes)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance (5 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Balance (2 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>A -80 freezer</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument</td><td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr><tr><td>Safety glasses</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lab coat</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette tips (Sizes : 1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 100 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, and 2 &amp;micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Transfer pipettes (size 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (Size: 100 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage&amp;reg; SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable purple nitrile gloves</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Top filter for E-914, cellulose</td><td>Buchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber</td><td>Buchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm</td><td>Buchi</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (diatomaceous earth)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm)</td><td>Merck</td><td>1.09385.5000</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Simga-Alrich</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Simga-Alrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;5&amp;rsquo;-dimethoxy-4&amp;rsquo;-acetophenone (acetosyringone)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>MP biomedicals</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE gel</td><td>Melford</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LB broth Millar</td><td>Simga-Alrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Simga-Alrich</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Alrich</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ambersep&amp;reg;&amp;nbsp;900 hydroxide (basic ion exchange resin)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Fisher</td><td>H/0406/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher</td><td>E/0900/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fisher</td><td>D/1852/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma-Alrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F1 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F2 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit).</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td><td>Supplier New England Biolabs Ltd</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>pEAQ-HT-DEST1 vector</td><td>Lomonossoff laboratory John Innes Center</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Thermo-Fisher</td><td>pDONR207</td><td></td></tr><tr><td>A. tumefaciens LBA4404</td><td>Thermo-Fisher</td><td>18313015</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M7822</td><td></td></tr><tr><td>PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP SET 100mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY PLANT MINI KIT</td><td>Qiagen Ltd</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNASE-FREE DNASE</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Fisher</td><td>10308632</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana seeds</td><td>any reputable supplier</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

transient expression in nicotiana benthamiana leaves for triterpene production at a preparative scale

Die TRITERPENE sind eines der größten und die meisten strukturell unterschiedlichen Familien von pflanzlichen Naturprodukten. Viele Triterpene Derivate haben gezeigt, dass medizinisch relevanten biologischen Aktivität besitzen. Allerdings hat dieses Potenzial bisher nicht in eine Fülle von Triterpene stammenden Drogen in der Klinik umgesetzt. Dies ist wohl (zumindest teilweise) führen eine Folge der begrenzten praktischen synthetischen Zugang zu dieser Klasse Verbindung, ein Problem, das die Erforschung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen und Entwicklung von ersticken kann Kandidaten durch traditionelle Arzneimittel Chemie-Workflows. Trotz ihrer immensen Vielfalt TRITERPENE alle stammen aus einer einzigen linearen Vorläufer 2,3-Oxidosqualene. Transiente heterologen Expression von biosynthetischen Enzymen in N. Benthamiana kann endogene Lieferungen von 2,3-Oxidosqualene auf die Herstellung von qualitativ hochwertigen Triterpene Neuheiten abzulenken, die natürlich nicht von diesem Host hergestellt werden. Agro-Infiltration ist eine effiziente und einfache Mittel zur Erreichung transiente Expression in N. Benthamiana. Der Prozess umfasst Infiltration der Blätter der Pflanze mit einer Suspension von Agrobacterium Tumefaciens tragen den Ausdruck Construct(s) von Interesse. Co Infiltration von einer zusätzlichen A. Tumefaciens Belastung tragen, ergibt sich ein Ausdruck Konstrukt Codierung, die ein Enzym, das Vorläufer Versorgung deutlich steigert erhöht. Nach einer Frist von fünf Tagen kann zu extrahieren und zu isolieren, die sich daraus ergebenden Triterpene Produkte die eingedrungene Blattmaterial geerntet und verarbeitet werden. Dies ist ein Prozess, der zuverlässig und Linear skalierbar ist einfach durch Erhöhung der Anzahl der Pflanzen in das Experiment. Hierin ist ein Protokoll für schnelle präparative-Produktion der TRITERPENE, die Verwendung dieser pflanzlichen Plattform beschrieben. Das Protokoll nutzt eine Vorrichtung leicht replizierbar Vakuum Infiltration, ermöglicht das gleichzeitige Eindringen von bis zu vier Anlagen, diskontinuierlichen Infiltration von Hunderten von Pflanzen in kurzer Zeit ermöglicht.

Typische isoliert Erträge sind abhängig von der Enzym/Enzym-Kombination unter Untersuchung, die chemische Stabilität der Ziel-Verbindung und wie anspruchsvoll der Reinigungsprozess war. Wir haben bereits berichtet, isolierten Ausbeute an β-Amyrin Derivate aus unserer kombinatorische Biosynthese-Experimente von 0,12 bis hin zu 3,87 mg pro Gramm trocken N. Benthamiana Blattpulver. Diese Verbindungen reichten weit in die Ebene der Oxidation und unnatürliche Kombinationen von Enzymen (Abbildung 3)8enthalten. Dieses Protokoll ist in unserem Labor routinemäßig, um Dutzende oder Hunderte von Milligramm gereinigten Produktes für strukturelle Charakterisierung zu produzieren durch NMR-Spektroskopie und nachgelagerten funktionelle Assays. Wir haben auch den präparativen nutzen diese Plattform gezeigt, durch die Herstellung von 0,8 g Triterpene Gerüst β-Amyrin in einer Reinheit von mehr als 98 %. Dieses Experiment 459 Pflanzen verwendet, und stellt eine isolierte Rendite von 3,3 mg pro Gramm des trocken N. Benthamiana Blatt Pulver8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Zusammenfassung. Schematische Darstellung des Prozesses nutzen transiente Expression von biosynthetischen Enzymen in N. Benthamiana Blatt, endogene Lieferungen von 2,3-Oxidosqualene in Richtung der präparativen Herstellung von hochwertigen Triterpene Neuheiten abzulenken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg"> Abbildung 2: Vakuum Infiltrator Konstruktion und Prozess. ein) Maßgeschneiderte Anlage Inhaber eines Flügels abgetrennt. b) Bespoke Pflanze Halter Flügel befestigt. ( c) Inversion und Eintauchen der Pflanzen. d) Einfügung des Bades Infiltration. e) Infiltration Bad im Ort innerhalb der Kammer eindringen. f) Complete Vakuum Infiltrator: (1) Vakuumpumpe (2) Verbindung von Vakuumpumpe Vakuum-Speicher (3) Vakuum-Behälter-Absperrventil (4) Verbindung zwischen Vakuum-Speicher und die Infiltration Kammer (5) Manometer (6) Luft Einlassventil (7) Infiltration (8) Kammer Vakuum Reservoir. g) Vertreter verlässt nach fünf Tagen Post-Infiltration Wachstum von einer Pflanze mit einem Ausdruck Konstrukt für grün fluoreszierendes Protein (GFP) infiltriert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg"> Abbildung 3: bereits berichtet repräsentative Ergebnisse für die präparative Herstellung von β-Amyrin-Derivaten, die mit diesem Protokoll8. Diese Tabelle ist durch isolierte Erträge bestellt. Spalten werden mit Ampelfarben relativen Wert bedingt formatiert. Rot = hoch, grün = niedrig (obwohl mittlere gelb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transiente Expression in Nicotiana Benthamiana Blätter für Triterpene Produktion im präparativen Maßstab

Transiente heterologen Expression von biosynthetischen Enzymen in Nicotiana Benthamiana Blätter kann endogene Lieferungen von 2,3-Oxidosqualene auf die Herstellung von qualitativ hochwertigen Triterpene Neuheiten abzulenken. Hierin ist ein detailliertes Protokoll für Rapid (5 Tage) präparative angelegte Produktion von TRITERPENE und Analoga, die unter Verwendung dieser leistungsstarken pflanzlichen Plattform beschrieben.

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

transient-expression-nicotiana-benthamiana-leaves-for-triterpene

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

17.1K Aufrufe.  John Innes Centre. Transiente heterologen Expression von biosynthetischen Enzymen in Nicotiana Benthamiana Blätter kann endogene Lieferungen von 2,3-Oxidosqualene auf die Herstellung von qualitativ hochwertigen Triterpene Neuheiten abzulenken. Hierin ist ein detailliertes Protokoll für Rapid (5 Tage) präparative angelegte Produktion von TRITERPENE und Analoga, die unter Verwendung dieser leistungsstarken pflanzlichen Plattform beschrieben.

Serie: Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Forschung

Umwelt

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture organisms, such as hyphae-building fungi and anaerobic bacteria, has hastened the use of recombinant technologies in this field. Plant expression methods are a desirable system for large-scale production of enzymes and other industrially useful proteins. Herein, methods for the transient expression of a fungal endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum are demonstrated. Successful protein expression is shown, monitored by fluorescence using an mCherry-enzyme fusion protein. Additionally, a set of basic tests are used to examine the activity of transiently expressed T. reesei Cel5A, including SDS-PAGE, Western blotting, zymography, as well as&#160;fluorescence and dye-based substrate degradation assays. The system described here can be used to produce an active cellulase in a short time period, so as to assess the potential for further production in plants through constitutive or inducible expression systems.

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tobacco plants were used to produce a fungal cellulase, TrCel5A, via a transient expression system. The expression could be monitored using a fluorescent fusion protein, and the protein activity was characterized post-expression.

Expression von rekombinanten Cellulase aus Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In Tabakpflanzen

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the additional advantage of short development and production times, but expression levels can vary significantly between batches thus giving rise to regulatory concerns in the context of good manufacturing practice. We used a design of experiments (DoE) approach to determine the impact of major factors such as regulatory elements in the expression construct, plant growth and development parameters, and the incubation conditions during expression, on the variability of expression between batches. We tested plants expressing a model anti-HIV monoclonal antibody (2G12) and a fluorescent marker protein (DsRed). We discuss the rationale for selecting certain properties of the model and identify its potential limitations. The general approach can easily be transferred to other problems because the principles of the model are broadly applicable: knowledge-based parameter selection, complexity reduction by splitting the initial problem into smaller modules, software-guided setup of optimal experiment combinations and step-wise design augmentation. Therefore, the methodology is not only useful for characterizing protein expression in plants but also for the investigation of other complex systems lacking a mechanistic description. The predictive equations describing the interconnectivity between parameters can be used to establish mechanistic models for other complex systems.

We describe a design of experiments approach that can be used to determine and model the influence of transgene regulatory elements, plant growth and development parameters, and incubation conditions on the transient expression of monoclonal antibodies and reporter proteins in plants.

Charakterisierung komplexer Systeme Mit dem Design of Experiments Ansatz: Transient Protein Expression in Tabak als Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Biotechnik

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

Ein anpassbarer Ansatz für die enzymatische Produktion und Reinigung von Diterpenoid Naturprodukten

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Biochemie

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Biologie

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Optimierung und Nutzung von<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Transient-vermittelte Proteinproduktion in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Eine vergleichende Analyse der Expression rekombinanter Proteine ​​in verschiedenen Biofabrik: Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensysteme

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Luciferase Komplementierung Imaging Assay in Nicotiana Benthamiana Blätter für Transient Bestimmung Proteinprotein Interaktion Dynamik

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

Produktion von IgG-Fusionsproteinen transient exprimiert in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Effiziente Extraktion und Reinigung von GFP-His aus N. benthamiana-Blättern

Apoplast-Extraction Based Method to Improve the Purity of Plant Produced Recombinant Protein

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from plants is one of the most critical steps in the production process. Typically, proteins were purified from total soluble proteins (TSP), and the presence of miscellaneous intracellular proteins and cytochromes poses challenges for subsequent protein purification steps. Moreover, most therapeutic proteins like antigens and antibodies are secreted to obtain proper glycosylation, and the presence of incompletely modified proteins leads to inconsistent antigen or antibody structures. This work introduces a more effective method to obtain highly purified recombinant proteins from the plant apoplastic space. The recombinant Green fluorescent protein (GFP) is engineered to be secreted into the apoplast of Nicotiana benthamiana and is then extracted using an infiltration-centrifugation method. The GFP-His from the extracted apoplast is then purified by nickel affinity chromatography. In contrast to the traditional methods from TSP, purification from the apoplast produces highly purified recombinant proteins. This represents an important technological improvement for plant production systems.

Autor im Rampenlicht: Optimierung der Apoplast Proteinextraktion für die effiziente Rückgewinnung rekombinanter Proteine aus Pflanzenzellen

The purification of recombinant proteins from plant systems is usually challenged by plant proteins. This work provides a method to effectively extract and purify a secreted recombinant protein from the apoplast of Nicotiana benthamiana.

Auf Apoplast-Extraktion basierende Methode zur Verbesserung der Reinheit von pflanzlich produzierten rekombinanten Proteinen  

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from ...

Transiente Expression in Nicotiana Benthamiana Blätter für Triterpene Produktion im präparativen Maßstab

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

Expression von rekombinanten Cellulase aus Cel5A

Charakterisierung komplexer Systeme Mit dem Design of Experiments Ansatz: Transient Protein Expression in Tabak als Case Study

Ein anpassbarer Ansatz für die enzymatische Produktion und Reinigung von Diterpenoid Naturprodukten

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Optimierung und Nutzung von

Eine vergleichende Analyse der Expression rekombinanter Proteine in verschiedenen Biofabrik: Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensysteme

Luciferase Komplementierung Imaging Assay in Nicotiana Benthamiana Blätter für Transient Bestimmung Proteinprotein Interaktion Dynamik

Produktion von IgG-Fusionsproteinen transient exprimiert in Nicotiana benthamiana

Auf Apoplast-Extraktion basierende Methode zur Verbesserung der Reinheit von pflanzlich produzierten rekombinanten Proteinen

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