Dieses Protokoll ist für eine robuste und kostengünstige Methode gedacht, die verwendet werden kann, um eine Vielzahl von Forschungsfragen im Zusammenhang mit der Funktion und der Rolle von Atemwegsepithelzellen bei Gesundheit und Krankheit zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zu einer Zellschicht führt, die eine gute Darstellung der menschlichen Epithelzellschicht darstellt, einschließlich der Schleimproduktion und der Ziliaraktivität. Diese Technik ist vielseitig und kann verwendet werden, um krankheitsbedingte Beleidigungen oder Therapien zu untersuchen.
Spülen Sie zunächst den aus menschlichem Lungengewebe isolierten Bronchialring mit 10 Millilitern sterilem PBS in einer 10 Zentimeter großen Petrischale. Während Sie den Ring mit einer Pinzette halten, verwenden Sie eine kleine Schere, um überschüssiges Bindegewebe und Blutreste zu entfernen. Schneiden Sie den Ring in zwei Teile und tauchen Sie zwei Hälften in 10 Milliliter vorgewärmte Protease 14-Lösung in HBSS mit Primocin in einem geschlossenen, sterilen Behälter.
Inkubieren Sie die Bronchialringstücke zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie die Stücke nach der Inkubation in eine Petrischale mit 10 Millilitern warmem PBS und kratzen Sie mit einer gebogenen Pinzette das Innere des Rings ab, um eine Zelllösung zu erhalten. Werfen Sie den Ring weg.
Übertragen Sie die Zelllösung in ein 50-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie warmes PBS hinzu, um ein Endvolumen von 50 Millilitern zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Zelllösung und saugen Sie den Überstand ab, bevor Sie das Pellet in 10 Milliliter warmem PBS wieder suspendieren. Füllen Sie das Volumen mit PBS auf 50 Milliliter auf und wiederholen Sie die Zentrifugation.
Suspendieren Sie das Pellet erneut in warmem, vollständigem KSFM, das Primocin enthält. Als nächstes ersetzen Sie die Beschichtungslösung von der Sechs-Well-Platte durch zwei Milliliter Zellsuspension pro Well. Lassen Sie die Zellen wachsen, bis eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreicht ist. Für die Kryokonservierung von PBECs wird das Medium aus den Vertiefungen abgesaugt und die Zellen einmal mit zwei Millilitern warmem PBS pro Vertiefung gewaschen.
Trypsinisieren Sie die Zellen durch Zugabe von 500 Mikrolitern weichem Trypsin pro Vertiefung und inkubieren Sie sie fünf bis 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Schwenken Sie die Trypsinlösung und lösen Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig auf die Platte klopfen. Die abgelösten Zellen werden in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit Soja-Trypsin-Inhibitor überführt.
Zentrifugieren Sie die Suspension und entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet in 10 Milliliter KSFM, das Penicillin und Streptomycin enthält, wieder suspendieren. Nachdem Sie die Zellen auf einem automatischen Zellzähler gezählt haben, suspendieren Sie die Zellen wieder auf eine Konzentration von 400.000 Zellen pro Milliliter in einem gefrierenden Medium und fügen Sie einen Milliliter dieser Suspension in ein Kryo hinzu. Füllen Sie die Fläschchen in einen Kühlzellenbehälter und stellen Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius.
Nach 24 Stunden werden die Fläschchen zur Langzeitlagerung auf minus 196 Grad Celsius flüssigen Stickstoff umgefüllt. Um einen T75-Zellkulturkolben zu beschichten, fügen Sie 10 Milliliter Beschichtungslösung in PBS hinzu und schließen Sie den Deckel fest, bevor Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einen Inkubator stellen. Ersetzen Sie am nächsten Tag die Beschichtungslösung aus dem Kolben durch 10 Milliliter komplettes KSFM.
Lassen Sie das Medium im Inkubator mit leicht geöffnetem Deckel auf 37 Grad Celsius erwärmen, damit der Inkubator auslüften kann. Tauen Sie die kryokonservierten PBECs schnell in einem 37 Grad Celsius heißen Perlenbad auf. Geben Sie den gesamten Inhalt des Kryos in den vorgewärmten T75-Kolben und verteilen Sie die Zellen gleichmäßig.
Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Zellen fest anhaften, ersetzen Sie das Medium durch 10 Milliliter frisches und warmes komplettes KSFM und lassen Sie sie wachsen, bis eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreicht ist. Beschichten Sie die Zellkultureinsätze mit 400 Mikrolitern Beschichtungslösung pro Einsatz und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Trypsinisieren Sie die PBECs im Kolben, indem Sie zwei Milliliter weiches Trypsin hinzufügen, und inkubieren Sie sie fünf bis 10 Minuten lang.
Erleichtern Sie die Zellablösung durch Schwenken und leichtes Klopfen des Kolbens. Als nächstes geben Sie vier Milliliter Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor in den Kolben und geben die Zellsuspension in ein 25-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Suspension und suspendieren Sie das Pellet erneut in sechs Millilitern des vollständigen BD-Mediums.
Zählen Sie die Zellen auf einem automatischen Zellzähler. Entfernen Sie nach dem Beschichten die Beschichtungslösung aus den Einsätzen. Verdünnen Sie die Zellsuspension mit vollständigem BD-Medium, das mit einem Nanomol EC 23 ergänzt wird, und geben Sie 500 Mikroliter auf die Oberseite der Membran der Einsätze.
Geben Sie 1,5 Milliliter komplettes BD-Medium in die Vertiefung unter dem Einsatz. Wenn die Zellen für den Transfer in die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) bereit sind, entfernen Sie das Medium aus den Einsätzen und der Vertiefung und geben Sie ein neues, vollständiges BD-Medium, das nur mit 50 Nanomolar EC 23 ergänzt wird, in die Vertiefung. Wechseln Sie das Medium in den Vertiefungen dreimal pro Woche.
Um überschüssigen Schleim und Zelltrümmer zu entfernen, fügen Sie vorsichtig 200 Mikroliter warmes PBS auf der apikalen Seite der Zellschicht im Inneren des Einsatzes hinzu und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation wird das PBS abgesaugt, das überschüssigen Schleim und Zelltrümmer enthält. Der TEER wurde gemessen, um die Qualität der ALI-PBEC-Kulturen zu beurteilen.
Nach sieben Tagen gilt der elektrische Widerstand der Zellschicht von mehr als 300 Ohm als erfolgreiche Kultur. Darüber hinaus verringerte sich die Variabilität des elektrischen Widerstands zwischen den Donoren im Laufe der Zeit zwischen dem siebten und dem 14. Tag der Kultivierung an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und wird deutlich durch die Herkunft des verwendeten DMEM beeinflusst. Alle wichtigen verschiedenen Zelltypen, wie Basal-, Flimmer-, Kelch- und Keulenzellen, wurden nach 14-tägiger ALI-Kultur beobachtet, und die Expressionsniveaus waren spenderabhängig.
Unter den verschiedenen Konzentrationen von EC 23 wurde ein maximaler TEER bei 50 Nanomolaren beobachtet. Ein Vergleich von Retinsäure und ihrem synthetischen Analogon EC 23 bestätigt, dass die Genexpression von Markern für Flimmer- und Kelchzellen zwischen 50 nanomolaren EC 23 und Retinsäure ähnlich war. Die Verwendung von Medien von verschiedenen Anbietern führte zu erheblichen Unterschieden in der zellulären Zusammensetzung, während die Unterschiede im TEER weniger ausgeprägt waren.
Andererseits führte die Verwendung von Inserts verschiedener Anbieter nicht zu wesentlichen Unterschieden in der zellulären Zersetzung. Darüber hinaus wurde ein Unterschied in den TEER-Werten und der zellulären Zusammensetzung des ALI-PBEC- und des PneumaCult-Mediums im Vergleich zum vollständigen BD-Medium beobachtet. Wenn die Zellen bereit sind, in ALI zu transferieren, erhöhen Sie die EC 23-Konzentrationen.
Zentrifugieren Sie die Zellen nach dem Auftauen auch nicht und entfernen Sie die Zellen nach der Zugabe von SBTI schnell aus Zellkulturkunststoffen. Mit Hilfe von Kulturen von Atemwegsepithelzellen, wie es in diesem Protokoll vorgesehen ist, können Sie dies mit einer Vielzahl von Analysemethoden verfolgen, um z. B. die Funktion, die Genexpression, die Mediatorproduktion der Atemwegsepithelzellen zu untersuchen und so beispielsweise einen Einblick in die Folgen einer Exposition gegenüber z. B. Zigarettenrauch zu erhalten. Der nächste Schritt für dieses Zellkulturprotokoll ist die Integration weiterer Zelltypen, wie z. B. Immunzellen oder Gefäßzellen, um die Geweberepräsentation zu erhöhen.
