Um die biologischen Aspekte des braunen Fettgewebes zu untersuchen, ist es wichtig, die gereinigte braune Fettgröße zu klären. Derzeit kam keine braune Fettgrößenreinigung und die Massen sind verfügbar. In dieser Studie haben wir ein einfaches Protokoll entwickelt, um dieses Problem anzugehen.
Nun sind für dieses Protokoll eine Fähigkeit erforderlich. Es benötigt viel weniger Untersuchungsmaterialien als andere Methoden und die gereinigte braune Fettgröße kann direkt für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse verwendet werden. Dieses Protokoll bietet eine neue Methode zur Untersuchung der Biologie der klassischen braunen Fettgröße.
Es kann auch angewendet werden, um den Bräunungsprozess der weißen Adipozyten zu untersuchen. Amanda, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstriert das Verfahren. Beginnen Sie, indem Sie den Kolben mit BAT und Aufschlusslösung 30 Minuten lang in einen Magnetrührer mit 60 Umdrehungen pro Minute in einem 35-Grad-Inkubator stellen.
Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um die aggregierten Gewebeklumpen von BAT-Scheiben um den Rührstab herum zu stören. Nach dem Aufschluss einen 70-Mikrometer-Siebfilter auf ein sauberes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen legen und etwa vier Milliliter Zellsuspension durch das Sieb pipettieren. Dann waschen Sie es mit vier Milliliter 12% Jodixanollösung.
Pipettieren Sie nach oben und unten, um die Zellen mit Jodixanollösung zu mischen, und überführen Sie dann die Zellmischung in zwei klare Fünf-Milliliter-Polystyrol-Reagenzgläser. Legen Sie die Polystyrolröhrchen mit der Zellmischung für eine Stunde auf Eis, wodurch die BAs eine Schicht auf der Oberseite bilden. Nehmen Sie 20 Mikroliter der isolierten BAs zur mikroskopischen Untersuchung heraus.
Für die RNA- und Proteinisolierung pipetten Sie die BA-Schicht in zwei 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Entfernen Sie dann vorsichtig die überschüssige iodixonale Lösung, ohne die BA-Schicht zu stören. Dann fügen Sie einen Milliliter TRIzol in die Zelllösung hinzu, um gleichzeitig RNA, DNA und Protein zu isolieren und ausreichend zu mischen, um die Zellen zu lyzieren.
Um die Phasen zu trennen, fügen Sie 200 Mikroliter Chloroform hinzu und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 9, 981 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie nach der Zentrifugation die wässrige Phase zur RNA-Isolierung. 300 Mikroliter der organischen Phase in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und 750 Mikroliter 100%iges Ethanol hinzufügen.
Nach dem Wirbeln für 10 Sekunden fügen Sie 200 Mikroliter 1-Brom-3-chlorpropan hinzu und wirbeln Sie erneut für 10 Sekunden. Fügen Sie 600 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser hinzu, bevor Sie 10 Sekunden lang wirbeln. Lassen Sie die Mischlösung 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen.
Nach dem Zentrifugieren 9, 981 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius hinzufügen. Die Phasen werden getrennt, wobei die Proteinphase in der mittleren Schicht lokalisiert ist. Entfernen Sie die obere wässrige Lösung und fügen Sie einen Milliliter 100% Ethanol in die restliche Lösung hinzu.
Nach dem Zentrifugieren bei 9, 981 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius wird der Überstand verworfen und das Pellet mit einem Milliliter 100%igem Ethanol gewaschen. Zentrifugieren bei 9, 981 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Entfernen des Überstands das Pellet 10 Minuten bei Raumtemperatur an der Luft trocknen und das Gewicht des nassen Pellets messen.
Fügen Sie 1% SDS-Lösung in einem Verhältnis von 20 Mikrolitern pro Milligramm Pellet hinzu. Lösen Sie das Pellet vollständig auf, indem Sie das Röhrchen für fünf bis 10 Minuten in einen erhitzten Shaker bei 55 Grad Celsius und 11 G geben. Im Protokoll wurde PBS mit 3% BSA verwendet, um BAs von BAT zu trennen.
Die isolierten Zellen waren himbeerförmig mit multilokulären Lipidtröpfchen im Inneren und waren tdTom-positiv, was bestätigte, dass sie BAs waren. Das Protein wurde mit einem verbesserten GTPC-Protokoll aus den BAs isoliert und anschließend mit einem SDS-PAGE-Gel untersucht. Eine dominante Bande, die mit BSA assoziiert ist, wurde in der BA-Probe beobachtet, was auf ihre Interferenz bei der Proteinextraktion hindeutet.
Um BSA-Interferenzen zu vermeiden, wurde eine 6%ige iodixonale Lösung zur Isolierung von BAs verwendet, die eine typische Himbeerform aufwiesen und multilokuläre Lipidtröpfchen enthielten. Die aus diesen BAs extrahierten Proteine wurden im SDS-PAGE-Gel gut getrennt. Diese Zellen erwiesen sich als tdTomato-positiv, während die aus dem Pellet gewonnenen Zellen tdTomato-negativ waren und keine offensichtlichen Lipidtröpfchen enthielten, was auf eine effiziente Trennung der BAs von den fettfreien Zellen hindeutet.
In der Genexpressionsanalyse waren die mRNA-Spiegel von UCP1 und PDGFA in den isolierten BAs signifikant höher. Die mRNA von PDGFRA wurde jedoch nur in BAT nachgewiesen. UCP1-Protein wurde in isolierten BAs angereichert.
EDGFR alpha wurde in BAT nachgewiesen, aber nicht in isolierten BAs. Diese Ergebnisse bestätigen die Effizienz der Methode zur Isolierung von BAs und zeigen, dass die isolierten BAs für Gen- und Proteinexpressionsstudien geeignet sind. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, verwenden Sie frischen Verdauungspuffer, um braunes Fettgewebe zu dissoziieren und die Bildung von Gewebeklumpen während der Verdauungsphase zu vermeiden.
Diese neue Methode macht es einfach, die Biologie von braunem Fettgewebe auf einer Einzelzell-Tap-Ebene zu untersuchen. Durch die Anwendung dieser Methode kann man GN- und Proteinexpressionsstudien mit reinen braunen Adipozyten durchführen, die das Genexpressionsprogramm für braune Adipozyten präzise sezieren, ohne sich Gedanken über eine Kontamination machen zu müssen, die ursprünglich von fettfreien Zellen stammt.
