Dieses Protokoll verwendet drei Ansätze, um festzustellen, ob Zigarettenrauch die bakterielle Belastung von Pseudomonas in Lungenepithelzellen beeinflusst. Diese Methode kann auf Endothelzellen oder andere Zelltipps erweitert werden. Die Vorbereitung der Zigarettenrauchextraktion, bakterielle Infektion und die Bestimmung mit einer bakteriellen Belastung sind in diesem Video ausführlich beschrieben.
Dieses Verfahren ist für die neuen Benutzer sehr einfach zu befolgen. Zeichnen Sie 10 Milliliter serumfreies Zellkulturmedium in eine 60-Milliliter-Spritze. Befestigen Sie das schmale Ende einer Trimmung auf eine Milliliter-Pipettenspitze an der Düse der Spritze, als Adapter, um die Zigarette zu halten.
Entfernen Sie den Filter von der Zigarette und befestigen Sie die Zigarette am Adapter. Nicht mehr als 30 Minuten vor der Durchführung des Testes verbrennen Sie die Zigarette und ziehen 40 Milliliter Rauch, der Luft in die Spritze. Mischen Sie den Rauch mit dem Medium, indem Sie die Spritze kräftig schütteln.
Wiederholen Sie den Ziehvorgang, bis die Zigarette vollständig ausgebrannt ist, was etwa 11 Ziehungen in etwa sieben Minuten erfordert. Um Mikroorganismen und unlösliche Partikel aus dem Medium zu entfernen, filtern Sie es durch einen 0,22-Mikron-Filter. Dann übertragen Sie das Medium in ein geschlossenes steriles Rohr.
Impfen Sie eine tryptische Sojabrühe oder TSB-Schneckenplatte mit einem ausgewählten Pseudomonas-Stamm. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie eine Tube mit 20 Milliliter TSB mit 5% Glycerin als Kohlenstoffquelle vor.
Sammeln Sie einen Abstrich von der Schneckenplatte und impfen Sie das TSB. Inkubieren Sie die Pseudomonas-Suspension in einem 37 Grad Celsius-Shaker bei 200 RPM, für etwa eine Stunde, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,6 beträgt. Nach der Kultivierung von Lungenepithelzellen, wie im Manuskript beschrieben, fügen Sie den Zellen einen Milliliter 0,25% Trypsin hinzu.
Nach etwa fünf Minuten, wenn sich die Zellen vollständig von der Unterseite der Platte gelöst haben, fügen Sie 10 Milliliter komplettes Heights-Medium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellen in eine 15 Milliliter-Röhre. Dann zentrifugieren Sie die Zellen für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und 300 Mal G.Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
Setzen Sie dann die Zellen mit 10% FBS wieder in Milliliter des Höhenmediums aus. Pipette 10 Mikroliter der Epithelzellsuspension auf eine neue Platte. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler, um die Zellkonzentration zu erhalten.
Die Lungenepithelzellen mit einer Konzentration von dreimal 10 bis fünf Milliliter, bei einem Gesamtvolumen von zwei Millilitern Medium pro Brunnen, verplatten. Inkubieren Sie die Platten über Nacht. Wenn die Zellen etwa 80 % Konfluenz erreichen, ersetzen Sie das Medium durch Das Medium Heights medium plus 1%FBS.
Dann 4%CSE in die Brunnen geben und die Platten drei Stunden lang bebrüten. Fügen Sie jedem Brunnen der MIT CSE behandelten Lungenepithelzellen eine Pseudomonas hinzu. Dann inkubieren Sie die Platten für eine Stunde bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Als nächstes ersetzen Sie das Medium in den sechs Brunnenplatten durch zwei Milliliter frisches Heights-Medium, das 4%CSE und 100 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin enthält. Nach dem Inkubieren der Platten für eine Stunde bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid, aspirieren Sie das Medium aus den Brunnen. Waschen Sie die mit Gentamycin behandelten Zellen zweimal mit zwei Millilitern kalter PBS.
Bakterienlast in den Lungenepithelzellen kann dann durch die Tropfplattenmethode, qRT-PCR oder Durchflusszytometrie nachgewiesen werden. Fügen Sie jedem Brunnen der Lungenepithelzellen einen Milliliter Zelllysepuffer hinzu. Reparieren Sie serielle Verdünnungen des Zelllysats, die von eins bis 10 bis eins bis 10 000 reichen.
Dann impfen Sie die TSB-Schneckenplatte. Bestimmen Sie nach 16 Stunden Inkubation, wie viele Kolonien bildende Einheiten in den Lungenepithelzellen vorhanden waren, indem Sie die Anzahl der Bakterienkolonien zählen. Fügen Sie 0,35 Milliliter des Guanidinium-Thiocyanat-Lysepuffers zu jedem Brunnen der Lungenepithelzellen hinzu.
Sammeln Sie die Zellen mit einem Zellschaber. Das Lysat in ein Mikrozentrifugenrohr geben und sanft mit der Pipette mischen. 0,35 Milliliter frisch zubereitet zu 70% Ethanol in das Lysat geben und gut vermischen.
Übertragen Sie alle Proben in eine Spin-Spalte, die in einem Zwei-Milliliter-Sammelrohr platziert ist. Zentrifugieren Sie das Sammelrohr 30 Sekunden lang bei 10.000 Mal G und 20 bis 25 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Puffer im Sammelrohr und waschen Sie die Säule mit 0,7 Milliliter Waschpuffer.
Zentrifugieren Sie die Säule 30 Sekunden lang bei 10.000 mal G. Waschen Sie die Säule zweimal mit 0,5 Milliliter Puffer. Wiederholen Sie die Zentrifugation bei 10.000 mal G für zwei Minuten.
Legen Sie die Säule in ein neues 1,5-Milliliter-Sammelrohr und fügen Sie 30 bis 50 Mikroliter RNase-freies Wasser hinzu. Nach der Zentrifugierung des Rohres bei 10.000 mal G für eine Minute, sammeln Sie den Durchfluss und messen Sie die RNA-Konzentration. Zur Vorbereitung auf eine 20 Mikroliter-Reverse-Transkriptionsreaktion wird ein Mikrogramm der gesamten RNA mit 10 Mikroliter Reaktionspuffer, einem Mikroliter Reverse-Transkriptase und RNase-freiem Wasser erstellt.
Führen Sie die Umgekehrte Transkriptionsreaktion bei 37 Grad Celsius für eine Stunde und dann bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten, nach dem Herstellerprotokoll. Mischen Sie dann einen Mikroliter jeder cDNA-Probe mit fünf Mikrolitern des Master-Mixes, der Cyberfarbstoff enthält, und einem Mikroliter jeder 200 nanomolaren spezifischen Grundierung. Fügen Sie Wasser für ein Gesamtvolumen von 20 Mikroliter hinzu.
Führen Sie pcR-Analysen gemäß den Empfehlungen des Herstellers durch. Und verwenden Sie dann die vergleichende CT-Methode, um den Ausdruck zu bestimmen. In BEAS-2B-Zellen änderte sich die Lebensfähigkeit nicht wesentlich, wenn Zellen drei Stunden lang mit 4%CSE behandelt wurden.
Eine Stunde als Pseudomonas-Infektion hatte auch keinen wesentlichen Einfluss auf die Lebensfähigkeit. Schließlich nutzten sie Gentamycin, um Pseudomonas im Kulturmedium zu töten, hatten keinen statistisch signifikanten Einfluss auf die Zelllebensfähigkeit. Gemessen an der Tropfplattenmethode wurde die bakterielle Infektion in BEAS-2B-Zellen durch die Behandlung mit CSE erheblich erhöht.
Dasselbe galt für die CSE-Behandlung von HSAEC. Die bakterielle Infektion von CSE-behandelten BEAS-2B-Zellen wurde auch mit RT-PCR bewertet, um die Menge an 16S rRNA zu quantifizieren, die auf eine Zunahme der Pseudomonas aeruginosa hindeutete. Die mit CSE behandelten und mit Pseudomonas fluoreszens Migula infizierten BEAS-2B-Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie mit 509 Nanometern analysiert.
Das Ergebnis zeigte auch, dass die CSE-Behandlung die bakterielle Infektion erhöht. Die Ergebnisse der fluoreszierenden Mikroskopie zeigten, dass GFP-markierte Bakterien in einem Pseudomonas-Fluoreszens-Migula-Infektionsexperiment mit BEAS-2B-Zellen kolokalisiert wurden. Zellen könnten Zigarettenrauch ausgesetzt werden, wenn Roboter rauchen, was menschliches Verhalten nachahmen und es ermöglichen kann, die Auswirkungen von Zigarettenrauch direkt auf Lungenepithelzellen zu untersuchen.
Diese Technik könnte verwendet werden, um einen Zigarettenrauch auf anderen Zellhähne im Zusammenhang mit einer Lungeninfektion zu erforschen. Der beschriebene Ansatz als Grundlage für die Entwicklung wirksamer Therapien gegen eine rauchende dorsale Lungenverletzung und C0PD extra
