Die Autoren bedanken sich für die Unterstützung der Thomas E. & Pamela M. Mischell Family Foundation für S.S. und der Harold C. Schott Foundation für die Finanzierung des Harold C. Schott Stiftungslehrstuhls am UC College of Medicine durch die Harold C. Schott Foundation für S.S.

Pharmakologisches Targeting von Ionenkanälen zur Behandlung solider Tumore

<ol>
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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+soluble+tetrazolium/formazan+assay+for+cell+growth+and+drug+sensitivity+in+culture+using+human+and+other+tumor+cell+lines.">Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines.</a> Cancer Research. 48 (17), 4827-4833 (1988).</li><li>Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+MTT+and+MTS-based+assays+for+measurement+of+antiproliferative+activity+of+green+tea+polyphenols.">Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols.</a> PLoS One. 5, e10202 (2010).</li><li>Berridge, M. V., Tan, A. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+pH+dependence+of+3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium+bromide-formazan+absorption+on+chemosensitivity+determined+by+a+novel+tetrazolium-based+assay.">Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay.</a> Cancer Research. 49 (16), 4435-4440 (1989).</li><li>Chakrabarti, R., Kundu, S., Kumar, S., Chakrabarti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+A+as+an+enzyme+that+catalyzes+the+reduction+of+MTT+to+formazan+by+vitamin+C.">Vitamin A as an enzyme that catalyzes the reduction of MTT to formazan by vitamin C.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 80 (1), 133-138 (2000).</li><li>Dong, G. W., Preisler, H. D., Priore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+limitations+of+in+vitro+clonogenic+drug+sensitivity+assays.">Potential limitations of in vitro clonogenic drug sensitivity assays.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 13 (3), 206-210 (1984).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM1-+and+Orai1-Mediated+Ca2+oscillation+orchestrates+invadopodium+formation+and+melanoma+invasion.">STIM1- and Orai1-Mediated Ca2+oscillation orchestrates invadopodium formation and melanoma invasion.</a> Journal of Cell Biology. 207 (4), 535-548 (2014).</li></ol>

D.A.P.K. ist Mitbegründer, Präsident und CEO von Amlal Pharmaceuticals Inc. S.S. ist Mitbegründer von Amlal Pharmaceuticals Inc. und sitzt im Drug Safety Monitoring Board von Bexion Pharmaceuticals, Inc.

Veränderungen in der Ionenkanalfunktion verändern intrazelluläre Signalkaskaden, was sich auf die Gesamtfunktion einer Zelle auswirken kann. In den letzten zehn Jahren wurde immer deutlicher, dass Ionenkanäle für das Wachstum und die Metastasierung von Krebszellen wichtig sind. Wichtig ist, dass viele Ionenkanäle primäre Ziele für zugelassene Therapeutika sind, die auf ein breites Spektrum von Erkrankungen abzielen24. Forscher haben untersucht, ob Ionenkanäle Ziele gegen Krebs sein könnt...

Membrantransportproteine sind entscheidend für die Kommunikation zwischen Zellen sowie für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase. Unter den Membrantransportproteinen dienen Ionenkanäle dazu, das Wachstum und die Entwicklung von Zellen voranzutreiben und den Zustand von Zellen in herausfordernden und sich verändernden Umgebungen aufrechtzuerhalten. Es wurde auch berichtet, dass Ionenkanäle die Entwicklung solider Tumore sowohl systemisch als auch im Zentralnervensystem (ZNS) vorantreiben und unterstützen1,2. Zum Beispiel sind KCa3.1-Kanäle für die Regulierung des Membranpotenzials und die Kontrolle des Zellvolumens verantwortlich, was für die Regulation des Zellzyklus wichtig ist. Es wurde berichtet, dass defekte KCa3.1-Kanäle zur abnormalen Proliferation von Tumorzellen beitragen3. Darüber hinaus können Ionenkanäle zur metastatischen Ausbreitung von Krebserkrankungen beitragen. Transiente Rezeptorpotentialkanäle (TRP) sind beispielsweise am Ca2+- undMg2+-Einstrom beteiligt; Dieser Einstrom aktiviert mehrere Kinasen und Hitzeschockproteine, die die extrazelluläre Matrix, die einen Tumor umgibt, regulieren, was wiederum für die Initiierung von Krebsmetastasen wichtig ist4.
Da Ionenkanäle zur Entstehung von Krebs beitragen können, können sie auch Ziele für die medikamentöse Krebsbehandlung sein. Zum Beispiel ist die Resistenz gegen Behandlungsmodalitäten, einschließlich Chemotherapie und neuartige Immuntherapie, mit einer Dysregulation der Ionenkanalfunktion verbunden 5,6,7. Darüber hinaus entwickeln sich Ionenkanäle zu wichtigen Angriffspunkten für Medikamente, um das Wachstum und die Entwicklung von Krebs zu hemmen, wobei umfunktionierte niedermolekulare (von der FDA zugelassene) Medikamente sowie Biopolymere, einschließlich monoklonaler Antikörper 1,2,8,9, untersucht werden. Obwohl es an dieser Front große Fortschritte gegeben hat, ist die Entdeckung von Medikamenten gegen Ionenkanalkrebs nach wie vor unterentwickelt. Dies ist zum Teil auf die besonderen Herausforderungen bei der Untersuchung von Ionenkanälen in Krebszellen zurückzuführen. Zum Beispiel gibt es technische Einschränkungen bei der Einrichtung von elektrophysiologischen Assays für langsam wirkende Verbindungen und zeitliche Unterschiede in der Kanalaktivierung und Arzneimittelwirkung. Darüber hinaus kann auch die Löslichkeit von Verbindungen den Fortschritt behindern, da die meisten der heute üblichen automatisierten elektrophysiologischen Systeme hydrophobe Substrate verwenden, die durch die Adsorption von Verbindungen zu Artefakten beitragen können. Darüber hinaus ist es technisch schwierig, große bioorganische molekulare Therapeutika wie Naturstoffe, Peptide und monoklonale Antikörper mit herkömmlichen elektrophysiologischen Assays zu screenen10. Schließlich sind die bioelektrischen Eigenschaften von Krebszellen nach wie vor unzureichend verstanden11.
Inzwischen ist die Immunfluoreszenzfärbung von Ionenkanälen oft eine Herausforderung. Dies ist zum Teil auf die Komplexität ihrer Strukturen und ihren Kontext in der Membran zurückzuführen, die sich auf die Fähigkeit auswirken, Antikörper für mikroskopische Studien sowohl zu generieren als auch einzusetzen. Es ist besonders wichtig, dass die Antikörper, die zur Färbung von Ionenkanälen verwendet werden, auf Spezifität, Affinität und Reproduzierbarkeit validiert sind. Kommerzielle Antikörper für Ionenkanäle sollten auf der Grundlage ihrer Validierungsstrategie und ihrer Publikationsbilanz in Betracht gezogen werden. Die Experimente sollten Negativkontrollen enthalten, um das Fehlen einer unspezifischen Bindung durch Knockdown oder Knockout des Zielproteins nachzuweisen. Alternativ können Zelllinien, in denen das Zielprotein fehlt oder in geringer Häufigkeit auf der Grundlage von mRNA- oder Proteinbestimmungen vorhanden ist, als Negativkontrollen dienen. Zum Beispiel zeigt diese Studie die Lokalisation der (GABA)-Rezeptor-Untereinheit Gabra5 in einer Medulloblastom-Zelllinie (D283). D283-Zellen mit einem siRNA-Knockdown und Daoy-Zellen, eine weitere Kleinhirn-Medulloblastom-Zelllinie, wurden für Gabra5 gefärbt und zeigten keine nennenswerte Färbung (Daten nicht gezeigt).
Hier werden Methoden vorgestellt, um die Funktion von Ionenkanälen sowie die Wirkung von Ionenkanalmodulatoren auf Krebszellen zu analysieren und zu testen. Es werden Protokolle für (1) die Färbung von Zellen für einen Ionenkanal, (2) die Prüfung des polarisierten Zustands von Mitochondrien, (3) die Feststellung der Ionenkanalfunktion mittels Elektrophysiologie und (4) die In-vitro-Validierung von Medikamenten bereitgestellt. Diese Protokolle konzentrieren sich auf Studien des Typ-A-Gamma-Aminobuttersäure-Rezeptors (GABA-A) 2,12,13,14,15,16, eines Chlorid-Anionenkanals und eines wichtigen inhibitorischen Neurotransmitterrezeptors. Die hier vorgestellten Methoden lassen sich jedoch auch auf viele andere Krebszellen und Ionenkanäle anwenden.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>ABS SpectraMax Plate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>ABS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Flor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td>Goat Anti-Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>Lacks vitamin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>302381101</td>
			<td>Class II, Type A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1606-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-211</td>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C7902</td>
			<td>Dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes, 150 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-600-004</td>
			<td>Cell culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, 75 cm2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>430641U</td>
			<td>Cell culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plates, 6 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353046</td>
			<td>Cell culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plates, 96 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353072</td>
			<td>Cell culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP-5804R</td>
			<td>Refrigerated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CoolCell</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 x 22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-553-450</td>
			<td>Corning brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D283 Med</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO Mounting Media</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17989-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, base media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11330-032</td>
			<td>With phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, phenol red free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21041-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>78006.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB120081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor, Basic</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GARBA5 Antibody</td>
			<td>Aviva</td>
			<td>ARP30687_P050</td>
			<td>Rabbit Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol Mounting Medium</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17989-60</td>
			<td>With DAPI+DABCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH3023701</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td>Solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Open platform</td>
			<td></td>
			<td>With Fiji plugins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno Mount DAPI</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17989-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRM-II-08</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>experimental compounds not available from a commercial source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td>Novus</td>
			<td>N276314100U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>Hexahydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, Confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, Light</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76382-982</td>
			<td>DMiL Inverted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS - Promega One Step</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipette, 0.5-10 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipette, 10-100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipette, 30-300 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nest-O-Patch</td>
			<td>Heka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Without vitamin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12348-017</td>
			<td>Phenol red free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOR-QH-II-66</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>experimental compounds not available from a commercial source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-998-944</td>
			<td>4 inch width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>RT-15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PATHCHMASTER</td>
			<td>Heka</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion System</td>
			<td>Nanion</td>
			<td>4000120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>EMS</td>
			<td>RT-15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Bufered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ75889K2</td>
			<td>Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A3890401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Port-a-Patch</td>
			<td>Nanion</td>
			<td>21000072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-34653</td>
			<td>Rabbit Monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propofol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0758676</td>
			<td>1 mL ampule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QH-II-66</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>experimental compounds not available from a commercial source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoirs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-664</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides, 75 x 25 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td>Frosted one side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-035-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synth-a-Freeze Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R00550</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-196-4741</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB113852</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>NC0704309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td>Solution, 0.4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td>Solution, 0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-927-841</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening ion channels in cancer cells

Ionenkanäle sind entscheidend für die Zellentwicklung und die Aufrechterhaltung der Zellhomöostase. Die Störung der Ionenkanalfunktion trägt zur Entwicklung eines breiten Spektrums von Erkrankungen oder Kanalopathien bei. Krebszellen nutzen Ionenkanäle, um ihre eigene Entwicklung voranzutreiben, sich als Tumor zu verbessern und sich in einer Mikroumgebung zu assimilieren, die verschiedene nicht-krebsartige Zellen enthält. Darüber hinaus kann ein Anstieg des Spiegels von Wachstumsfaktoren und Hormonen in der Mikroumgebung des Tumors zu einer erhöhten Expression von Ionenkanälen führen, was zur Proliferation und zum Überleben von Krebszellen beiträgt. Daher ist das pharmakologische Targeting von Ionenkanälen potenziell ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung solider Malignome, einschließlich primärer und metastasierender Hirntumoren. In dieser Arbeit werden Protokolle zur Charakterisierung der Funktion von Ionenkanälen in Krebszellen und Ansätze zur Analyse von Modulatoren von Ionenkanälen beschrieben, um ihren Einfluss auf die Lebensfähigkeit von Krebs zu bestimmen. Dazu gehören die Färbung einer Zelle(n) für einen oder mehrere Ionenkanäle, das Testen des polarisierten Zustands von Mitochondrien, die Feststellung der Ionenkanalfunktion mithilfe von Elektrophysiologie und die Durchführung von Viabilitätstests zur Beurteilung der Wirksamkeit von Arzneimitteln.

Membrane transport proteins are critical for communication between cells, as well as for maintaining cellular homeostasis. Amongst the membrane transport proteins, ion channels serve to drive the growth and development of cells and to maintain the state of cells in challenging and changing environments. Ion channels have also been reported to drive and support the development of solid tumors, both systemically and in the central nervous system (CNS)1,2. For example, KCa3.1 channels are responsible for regulating membrane potential and controlling cell volume, which is important in cell-cycle regulation. Defective KCa3.1 channels have been reported to contribute to the abnormal proliferation of tumor cells3. Further, ion channels may contribute to the metastatic dissemination of cancers. Transient receptor potential (TRP) channels, for example, are involved in Ca2+ and Mg2+ influx; this influx activates several kinases and heat shock proteins that function to regulate the extracellular matrix surrounding a tumor, which is, in turn, important for initiating cancer metastasis4.
Since ion channels can contribute to the development of cancers, they may also be targets for drug-related cancer treatment. For example, resistance to treatment modalities, including chemotherapy and novel immunotherapy, is related to ion channel function dysregulation5,6,7. In addition, ion channels are emerging as important drug targets to impede the growth and development of cancers, with repurposed small molecule (FDA-approved) drugs being examined, as well as biopolymers, including monoclonal antibodies1,2,8,9. While there has been much progress on this front, ion channel cancer drug discovery remains underdeveloped. This is partly due to the unique challenges of studying ion channels in cancer cells. For example, there are technical limitations in setting up electrophysiology assays for slow-acting compounds and temporal differences in channel activation and drug action. Further, the solubility of compounds can also impede progress, as most of the automated electrophysiology systems commonly in use today utilize hydrophobic substrates, which may contribute to artifacts as a result of compound adsorption. In addition, large bioorganic molecular therapeutics such as natural products, peptides, and monoclonal antibodies are technically challenging to screen using conventional electrophysiology assays10. Finally, the bioelectrical properties of cancer cells remain poorly understood11.
Meanwhile, the immunofluorescence staining of ion channels is often challenging. This is due, in part, to the complexity of their structures and their context in the membrane, which impact the ability to both generate and employ antibodies for microscopy studies. It is especially important that the antibodies used to stain ion channels are validated for specificity, affinity, and reproducibility. Commercial antibodies for ion channels should be considered based on their validation strategy and publication record. Experiments should include negative controls to demonstrate the lack of nonspecific binding by either knockdown or knockout of the target protein. Alternatively, cell lines in which the target protein is absent or in low abundance based on mRNA or protein determinations may serve as negative controls. For example, this study shows the localization of the (GABA) receptor&#160;subunit Gabra5 in a medulloblastoma cell line (D283). D283 cells with an siRNA knockdown and Daoy&#160;cells, another cerebellar medulloblastoma cell line, were stained for Gabra5 and showed no appreciatable staining (data not shown).
Here, methods are presented to analyze and assay ion channel function, as well as the effect of ion channel modulators on cancer cells. Protocols are provided for (1) staining cells for an ion channel, (2) testing the polarized state of mitochondria, (3) establishing ion channel function using electrophysiology, and (4) in vitro drug validation. These protocols emphasize studies of the type A gamma-aminobutyric acid (GABAA) receptor2,12,13,14,15,16, a chloride anion channel and major inhibitory neurotransmitter receptor. However, the methods presented here apply to studying many other cancer cells and ion channels.

Autor im Rampenlicht: Erforschung der Rolle von Ionenkanälen bei Krebs: Charakterisierung und mögliche Behandlungsansätze 

Screening von Ionenkanälen in Krebszellen

The function of ion channels is crucial in cell biology and significantly impacts cancer growth. Our team is focused on targeting ion channels to aid cancer treatments. The field has recently gained a greater understanding of the tumor microenvironment and how cancer cells take hold in healthy tissue, highlighting the importance of ion channels in cancer.One of the biggest challenges in current experiment is the availability of immune-competent animal model that can effectively test therapeutic treatments. We have established that GABA A receptor is a therapeutic vulnerability to disparate cancers and identified a new class of GABA A receptor activators that effectively impair cancer cells. Ion channels play a crucial role in regulating cancer cell behavior, and they hold great potential as target for cancer treatment.Our research has highlighted how an established class of drug can be employed to treat cancer effectively.

Oben sind ausgewählte Verfahren aufgeführt, die zur Charakterisierung von Ionenkanälen in Krebszellen eingesetzt werden können. Das erste Protokoll hebt die Färbung eines Ionenkanals hervor. Wie bereits erwähnt, gibt es viele Herausforderungen bei der Färbung eines Ionenkanals oder eines Proteins, das in der extrazellulären Membran vorhanden ist. In Abbildung 1 ist die Färbung für eine Untereinheit des pentameren GABA-A-Rezeptors dargestellt. Das zweite Protokoll hebt di...

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Das pharmakologische Targeting von Ionenkanälen ist ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung solider Tumore. Es werden detaillierte Protokolle zur Charakterisierung der Ionenkanalfunktion in Krebszellen und zur Untersuchung der Auswirkungen von Ionenkanalmodulatoren auf die Lebensfähigkeit von Krebs bereitgestellt.

Ion channels are critical for cell development and maintaining cell homeostasis. The perturbation of ion channel function contributes to the development ...

Die Funktion von Ionenkanälen ist in der Zellbiologie von entscheidender Bedeutung und beeinflusst das Krebswachstum erheblich. Unser Team konzentriert sich auf das Targeting von Ionenkanälen zur Unterstützung von Krebsbehandlungen. Das Gebiet hat in jüngster Zeit ein besseres Verständnis der Mikroumgebung von Tumoren und der Art und Weise, wie Krebszellen in gesundem Gewebe Fuß fassen, gewonnen, was die Bedeutung von Ionenkanälen bei Krebs unterstreicht.Eine der größten Herausforderungen im aktuellen Experiment ist die Verfügbarkeit eines immunkompetenten Tiermodells, mit dem therapeutische Behandlungen effektiv getestet werden können. Wir haben festgestellt, dass der GABA-A-Rezeptor eine therapeutische Anfälligkeit für unterschiedliche Krebsarten darstellt, und eine neue Klasse von GABA-A-Rezeptoraktivatoren identifiziert, die Krebszellen effektiv beeinträchtigen. Ionenkanäle spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Verhaltens von Krebszellen und bergen ein großes Potenzial als Ziel für die Krebsbehandlung.Unsere Forschung hat gezeigt, wie eine etablierte Klasse von Medikamenten eingesetzt werden kann, um Krebs effektiv zu behandeln.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Screening Ion Channels in Cancer Cells

1.4K Aufrufe.  University of Cincinnati College of Medicine. Die Funktion von Ionenkanälen ist in der Zellbiologie von entscheidender Bedeutung und beeinflusst das Krebswachstum erheblich. Unser Team konzentriert sich auf das Targeting von Ionenkanälen zur Unterstützung von Krebsbehandlungen. Das Gebiet hat in jüngster Zeit ein besseres Verständnis der Mikroumgebung von Tumoren und der Art und Weise, wie Krebszellen in gesundem Gewebe Fuß fassen, gewonnen, was die Bedeutung von Ionenkanälen bei Krebs unterstreicht.Eine der größten Herau...

Serie: Autor im Rampenlicht: Erforschung der Rolle von Ionenkanälen bei Krebs: Charakterisierung und mögliche Behandlungsansätze 

Ion channels are critical for cell development and maintaining cell homeostasis. The perturbation of ion channel function contributes to the development of a broad range of disorders or channelopathies. Cancer cells utilize ion channels to drive their own development, as well as to improve as a tumor and to assimilate in a microenvironment that includes various non-cancerous cells. Furthermore, increases in levels of growth factors and hormones within the tumor microenvironment can result in enhanced ion channel expression, which contributes to cancer cell proliferation and survival. Thus, the pharmacological targeting of ion channels is potentially a promising approach to treating solid malignancies, including primary and metastatic brain cancers. Herein, protocols to characterize the function of ion channels in cancerous cells and approaches to analyze modulators of ion channels to determine their impact on cancer viability are described. These include staining a cell(s) for an ion channel(s), testing the polarized state of mitochondria, establishing ion channel function using electrophysiology, and performing viability assays to assess drug potency.

The pharmacological targeting of ion channels is a promising approach to treating solid tumors. Detailed protocols are provided for characterizing ion channel function in cancer cells and assaying the effects of ion channel modulators on cancer viability.

Forschung

Krebsforschung

Testing the Polarized State of Mitochondria to Analyze the Ion Channel Function in Cancer Cells 

To begin, maintain cells in a 75-square-centimeter culture flask. Aspirate the culture medium and rinse the cells with PBS without calcium and magnesium. Next, add two milliliters of 0.25%trypsin EDTA to detach adherence cells.Incubate for five minutes at room temperature and resuspend the cells in 10 milliliters of medium. Next, collect the cells from the flask into a 15-milliliter centrifuge tube. Centrifuge at 480 G for five minutes at room temperature and aspirate the medium.Resuspend the cells in 5 to 10 milliliters of medium based on the original confluency of the culture. Remove 100 microliters of cells and add to a 1.5-milliliter tube with 100 microliters of 0.4%trypan blue. Add the cells to the hemocytometer, and count them by observing under the microscope and using the manual tally counter.Dilute the cells to three times 10 to the fourth cells per milliliter in the culture medium without phenol red. Add 2.5 milliliters of the cell suspension to each well of a six-well plate with poly-D-lysine-coated cover slip per the manufacturer's directions. Grow the cells overnight at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide in a humidified incubator to enable cell attachment to the cover slip.The next day, examine cell attachment under an inverted microscope using a 20X objective. Prepare the treatment stock solutions at the desired concentrations and create a media-only control, a vehicle-only control at a concentration that matches the test compound, and a control with the ionophore FCCP and the test compounds. Working with one cover slip at a time, add 1.8 milliliters of medium for the condition under the study to the cells.Incubate the cells treated with either the control or test compound at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide in a humidified environment for the desired time. Following the treatment period, add 200 microliters of 10X TMRE to the cells. Incubate for 15 to 30 minutes at 37 degrees Celsius in a 5%carbon dioxide humidified environment.Gently aspirate the medium and rinse the cells two times with PBS to minimize background interference. Then invert the cover slip onto a microscope slide labeled with the treatment conditions. Image the cells live at 549 nanometers excitation and 575 nanometers emission.Utilize a confocal microscope to capture several Z-stack fields with high-speed image capture before the cell integrity is lost. Save and store the image file for later analysis. The cells with active mitochondria retained TMRE staining and showed high fluorescence.Depolarized or inactive mitochondria have reduced membrane potential, fail to retain TMRE, and show a low fluorescence signal.

Untersuchung des polarisierten Zustands von Mitochondrien zur Analyse der Ionenkanalfunktion in Krebszellen 

In Vitro Drug Validation to Assay Ion Channel Function in Cancer Cells

To begin, plate the cells in 75 microliters per well of antibiotic-free medium without HEPES buffer to determine the IC50. On the second day, prepare the control solution and the test solutions by performing serial dilutions of high-concentration stock solutions. After adding control and test solutions to the cells, incubate the cells at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide in a humidified environment for 48 hours.Begin the cell proliferation assay by first vortexing the MTS reagent to fully dissolve any precipitated reagent before usage on day three of the experiment transfer the thawed MTS reagents into a sterile, 25-milliliter reagent reservoir. Pipette 20 microliters of MTS reagent into each well of the 96-well plate containing samples and 100 microliters of culture medium. Incubate the plate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide in a humidified environment for one to four hours.Then, centrifuge the plate at room temperature to remove any bubbles that may interfere with the absorbance reading. Measure the absorbance at 490 nanometers with a microplate reader or spectrophotometer. A 96-well plate showing the calorimetric results of an MTS assay with increasing drug concentrations is presented.The dose response curve showed that the test agent impairs the viability of the cancer cells in a dose-dependent manner.