Der Zugriff auf neuronale microRNA-Zielinteraktionen mit MicroRNA-Funktionen ist entscheidend, um zu verstehen, wie MicroRNAs verschiedene biologische Prozesse sowohl in gesunden als auch in krankheitserlichen Zuständen regulieren. Dieses Protokoll beschreibt die Reproduktion durch Strategie zur Identifizierung von microRNA-Zielen und der funktionalen microRNAs als die Validierung des direkten Ziels von microRNAs ist eine Herausforderung. Unser Protokoll kann Einblicke in die Funktion einzelner microRNAs und die Implikation einer microRNA in der Krebstherapie geben.
Die Berechnung der halbmaximalen hemmenden Konzentration ist eine wichtige Methode, nicht nur für microRNA-Studien, sondern auch für die wirksame Bewertung anderer Krebsmedikamente. Unser Protokoll wird für neue Forscher hilfreich sein, da wir die grundlegende Methode beschrieben haben, um den Grad der microRNAs in einer Zelle zu verstehen. Um das Protokoll zu beginnen, zählen Sie die Zellen mit dem Zellenzähler.
Die Zellen in einer 96-Well-Platte verkleben. Am nächsten Tag bereiten Sie eine Reihe von Transfektionsmischungen vor, um die Zellen in mehreren endklichen Konzentrationen von microRNA-Kontrollmimik und microRNA-107-Mimik zu transfekieren. Aus einem Bestand von 25 mikromolaren microRNA-Kontrollmimik, oder microRNA-107 mimik, verdünnen und fügen Sie Kontrollmimik oder microRNA-107 Mimik in den reduzierten Serummedien zusammen mit der Transfektion Reagenz in Mikrozentrifugenröhren.
Mischen Sie die oligohaltigen Mischungen vorsichtig mit einer Mikropipette. Nach einer 10-minütigen Inkubation in der Zellkulturhaube die oligohaltigen Mischungen vorsichtig wieder mischen und dann 50 Mikroliter der Mischungen in jeden Brunnen geben. Bewahren Sie die transfizierten Zellen in einem Zellkultur-Inkubator auf.
Saugen Sie vorsichtig die Zellkulturmedien in jedem Brunnen der Platte und füllen Sie sofort 100 Mikroliter 10%trichloresessäure, oder TCA, in jeden Brunnen. Halten Sie die Platte mit 10% TCA bei vier Grad Celsius für eine Stunde. Als nächstes waschen Sie die Platte mehrmals, indem Sie sie in eine Wanne mit Leitungswasser tauchen.
Entfernen Sie überschüssiges Wasser aus dem Inneren der Brunnen, indem Sie die Platte anzapfen, bis kein Wasser mehr vorhanden ist, und trocknen Sie die Platte. Pipette 50 Mikroliter 0,4%SRB Lösung in jeden Brunnen einschließlich der leeren Brunnen. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, bis die 0,4%SRB-Lösung den Boden der Brunnen gleichmäßig abdeckt.
Dann inkubieren Sie die Platte für 40 bis 60 Minuten. Nach der Inkubation die Platte mit 1%essigsäure waschen, bis der ungebundene Farbstoff vollständig weggespült wird. Pipette 100 Mikroliter 10 Millimolar Tris Basislösung in die entsprechenden Brunnen, einschließlich Leerbrunnen.
Halten Sie die Platte 10 Minuten auf einem Shaker. Messen Sie die Absorption bei 492 Nanometern. Berechnen Sie den Prozentsatz der durchschnittlichen Absorption und die Standardabweichung jeder Gruppe unter Verwendung der Absorptionswerte des SRB-Assays.
Importieren Sie die Rohdaten einschließlich Behandlungskonzentrationen, durchschnittlicher Absorption und Standardabweichung in die Software, indem Sie die Daten vertikal ausrichten. Klicken Sie auf die Registerkarte Diagramm erstellen, und wählen Sie die einfachen Streuungsfehlerleisten aus. Wählen Sie Arbeitsblattspalten als Symbolwerte aus, und klicken Sie auf Weiter.
Wählen Sie im Datenformat-Bedienfeld X-Y-Paare aus, und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie entsprechende Datenspalten im Bedienfeld Daten auswählen aus. Klicken Sie auf Fertigteil, um das Diagramm zu erstellen.
Doppelklicken Sie auf die X-Achse, um den Maßstabstyp in der Skalierung der Achse zu ändern. Ändern Sie den Maßstabstyp von linear in protokollieren. Ändern Sie die Start- und Endbereichsnummer auf 0,01 bzw. 200.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf ein beliebiges Streudiagramm, wählen Sie Kurvenanpassung aus, und wechseln Sie zur Unterkategorie Benutzerdefiniert. Wählen Sie die Dosis-Antwort-Kurve aus. Klicken Sie auf die nächsten Schaltflächen, und klicken Sie dann auf Fertig stellen.
Wechseln Sie zur Registerkarte Bericht, und überprüfen Sie dann die N-, K- und R-Werte. Führen Sie die PCR wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben aus. Dann gehen Sie zur Doppeltenverdauung durch die Kombination der Reaktionsmischungen, einschließlich der Restriktionsenzyme Exo1 und Not1 eins in einer Röhre.
Inkubieren Sie die Mischungen für drei bis vier Stunden in einem 37 Grad Celsius Wasserbad. Führen Sie die doppelt verdaulichen Produkte auf einem 1%Agarose-Gel aus. Dann schneiden Sie die Bänder unter UV-Licht.
Reinigen Sie die doppelt verdaulichen PCR-Produkte und Luziferase-Vektoren aus den ausgeschnittenen Bändern. Fahren Sie mit der Ligation der PCR-Produkte in die Luziferase-Vektoren fort, indem Sie 20 Mikroliter Ligationsreaktionsmischungen einschließlich der DNA-Ligase vorbereiten. Das Rohr 10 bis 15 Sekunden lang kurz zentrieren.
Inkubieren Sie die Ligation bei 16 Grad Celsius über Nacht mit einem thermischen Cycler. Führen Sie am nächsten Tag die Transformation durch, indem Sie die Ligationsmischungen in das Rohr mit kompetenten Zellen einfügen. Tippen Sie vorsichtig auf die Röhre und halten Sie sie 20 Minuten auf Eis.
Übertragen Sie das Rohr schnell und vorsichtig auf einen Wärmeblock bei 42 Grad Celsius für 30 Sekunden bis eine Minute. Nach einem Hitzeschock 20 Minuten lang die Röhre auf Eis legen. Verteilen Sie kompetente Zellen auf einer LB-Agarplatte.
Wachsen Sie kompetente Zellen in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Tag wählen Sie eine einzelne Kolonie und setzen E.coli in einem der 8-Streifen-Rohre mit Reinstwasser wieder aus, und wiederholen Sie diesen Schritt, um E.coli von vier auf acht zufällig ausgewählte Kolonien zu suspendieren. 25 Mikroliter E.coli Suspension in einen anderen Satz 8-Band-Röhren übertragen.
Führen Sie die Kolonie PCR mit der E.coli Suspension durch. Bereiten Sie die luziferase Assay in einem 24 Brunnen Platte. Fügen Sie ein bis zwei mal zehn zu den vier Zellen in einem 500 Mikroliter-Zellkulturmedium für jeden Brunnen hinzu.
Nach der nächtlichen Inkubation transfezieren Sie 50 Nanogramm Luziferase-Vektoren mit Kontrollmimik oder einer spezifischen microRNA-Mimik mit einem Transfektionsreagenz in die Zellen. Am nächsten Tag das Innere der Brunnen zweimal mit Phosphat gepufferter Saline waschen. Tragen Sie 200 Mikroliter Lysereagenz in die Brunnen auf und führen Sie die Zelllyse ausreichend durch, bevor Sie die Luziferaseaktivität messen.
Halten Sie die Platte mindestens 15 Minuten schütteln. Fünf bis zehn Mikroliter Zelllysat in das neue Rohr geben, 100 Mikroliter Reagenz eins hinzufügen und die Lösung sofort durch Pipettieren mischen. Dann lesen Sie die Galleife-Aktivität mit Illuminometer für 10 bis 15 Sekunden.
Fügen Sie 100 Mikroliter Reagenz zwei in der gleichen Röhre und dann mischen durch Pipettieren zweimal. Schließlich lesen Sie die Renilla-Luziferase-Aktivität für 10 bis 15 Sekunden mit Deminometer. RTPCR zeigt eine signifikante Reduktion von microRNA-107 und PANC-1 und CAPAN-1 Zellen im Vergleich zu HPNE-Zellen.
Die Konzentrationen von microRNA-301 wurden in PANC-1- und CAPAN-1-Zellen im Vergleich zu HPNE-Zellen signifikant hochreguliert. Der SRB-Assay in dieser Studie zeigt deutlich, dass die Proliferation von PANC-1-Zellen nach einer mikroRNA-107-Mimiktransfektion abnahm. Das Screening von 11 potentiellen vorhergesagten Zielen von microRNA-107 zeigt deutlich, dass nur Synuclein-Gamma oder SNCG, ein positiver Regulator des Tumorzellwachstums, direkt mit microRNA-107- und PANC-1-Zellen interagiert, was darauf hindeutet, dass microRNA-107 die Proliferation von PANC-1-Zellen negativ regulieren kann, indem die SNCG-Expression moduliert wird.
Adult cell proliferation assays, die die Tetrahydroleum-basierte Einheit und CFSE verwenden, sind anwendbar, um die Wirkung von wie microRNA Mimiks zu überprüfen, abhängig von den Zelltypen. Basierend auf der experimentell validierten Funktion von microRNAs ist eine systematische Überprüfung des Datenbank- und Zielvorhersageprogramms erforderlich, um die Liste der Kandidatenziele vor Luziferase-Assays einzugrenzen. Für die Bewertung der Kombinationseffizienz von microRNAs mit Krebsmedikamenten ist es vorteilhaft, angepasste IC-Werte auf Basis unseres Protokolls zur Bewertung des Kombinationsindex zu berechnen.
