Die Autoren möchten den Mitgliedern des Clinical Pathology Research Institute West China Hospital danken, die technische Leitlinien für eine qualitativ hochwertige Multiplex-Immunfluoreszenz und IHC-Verarbeitung beigesteuert haben. Dieses Protokoll wurde von der National Natural Science Foundation of China (82200078) unterstützt.

Das Protokoll ist nach den Richtlinien der Ethikkommission des West China Hospital, Sichuan University, China, genehmigt. Die Lungenkrebsgewebeproben wurden während der Operation im Zentrum für Lungenkrebs am West China Hospital entnommen, und von jedem Patienten wurde eine Einverständniserklärung eingeholt.
1. Vorbereitung des Gewebeschnitts
<ol><li>FFPE-Vorbereitung<ol><li>Tauchen Sie klinisches Gewebe länger als 72 Stunden in neutrale Formalinlösung.</li>
		<li>Schließen Sie den Prozess der Dehydrierung des Gewebes mit Xylol und abgestuften alkoholischen Lösungen20 ab.</li>
		<li>Führen Sie eine manuelle Paraffineinbettung und Gewebeschnitte bei einer Schnittdicke von 4 μm durch. Verwenden Sie Adhäsionsmikroskop-Objektträger, um sicherzustellen, dass die Gewebescheiben nicht herausfallen.</li>
		<li>Die Objektträger im Backofen bei 65 °C 2 h backen, damit das Taschentuch und die Objektträger trocken sind. In einer Objektträgerbox bei Raumtemperatur aufbewahren.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbehandlung von Gewebeschnitten<ol><li>Die Gewebeobjektträger in einem Ofen bei 65 °C für 5 min vorbehandeln und dann nacheinander 2 x 15 min lang in Xylollösungen, 2 x 15 min in wasserfreie Ethanollösungen, 10 min 90%ige Ethanollösung, 10 min 85%ige Ethanollösung, 10 min 80%ige Ethanollösung und 10 min 75%ige Ethanollösung eintauchen. Anschließend werden die Objektträger 3 x 1 min lang mit sterilisiertem Wasser gewaschen. HINWEIS: Diese experimentelle Technik kann nur für FFPE-Gewebe verwendet werden, nicht für gefrorenes oder frisches Gewebe, da der mehrfache Hochtemperatur-Antigenreparaturprozess dazu führt, dass das Gewebe vom Objektträger fällt.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Optimierung des Primärantikörpers
HINWEIS: Konventionelle IHC-Experimente wurden verwendet, um die Inkubationsbedingungen für einzelne Antikörper zu bestimmen, hauptsächlich einschließlich Antikörperkonzentration und Antigenreparaturbedingungen. Beachten Sie die Bedingungen in der Bedienungsanleitung für Antikörper.
<ol><li>Verwenden Sie eine Antikörperkonzentration, die etwas höher ist als der empfohlene Konzentrationsbereich und die empfohlenen Zwischenwerte.</li>
	<li>Optimieren Sie die Antigen-Retrieval-Pufferroutinen PH6 und PH9 entsprechend dem Ort der Proteinexpression. Verwenden Sie PH9 für Proteine, die im Zellkern exprimiert werden, und verwenden Sie entweder Routine (PH6 oder PH9) für andere Proteine.</li>
</ol>3. mIHC-Färbemethode
HINWEIS: Die opale mIHC-Färbung ist eine der verfügbaren mIHC-Methoden. Da in diesem experimentellen 5-Farben-Protokoll jede Gewebeprobe mit vier Antikörpern gefärbt werden muss, werden vier primäre Antikörperinkubationen, sekundäre Antikörperinkubationen und TSA-Signalamplifikations-chromogene Inkubationen sowie fünf Antigenrestaurationen benötigt. Schließlich werden eine 4'6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Färbung und eine Anti-Fluoreszenz-Berstmittelversiegelung durchgeführt.
<ol><li>Vorbereitung des Hauptreagenzes HINWEIS: Bestimmen Sie die Menge des hinzuzufügenden Reagenzes entsprechend der Größe der Gewebeobjektträger. Verwenden Sie genügend Volumen, um den Gewebeschnitt vollständig zu bedecken (in der Regel 50-150 μl pro Objektträger). Die für das Experiment erforderlichen Arbeitslösungen werden wie folgt hergestellt:<ol><li>Arbeitslösung für Waschpuffer: 20x Waschpuffer bei 1:20 mit doppelt destilliertem Wasser verdünnen und bei Raumtemperatur lagern.</li>
		<li>PH6-Puffer-Arbeitslösung: 100x PH6-Puffer bei 1:100 mit doppelt destilliertem Wasser verdünnen. Vor Gebrauch vorbereiten und bei Raumtemperatur lagern.</li>
		<li>PH9-Puffer-Arbeitslösung: 50x PH9-Puffer bei 1:50 mit doppelt destilliertem Wasser verdünnen. Vor Gebrauch vorbereiten und bei Raumtemperatur lagern.</li>
		<li>Polymer HRP: Bereiten Sie diese gebrauchsfertige Lösung nur für Primärantikörper Kaninchen- und Mausursprung vor.</li>
		<li>Fluorophor-Arbeitslösung: Rekonstituieren Sie jedes Fluorophorpulver (außer Fluorophor 780) in 75 μl DMSO. Verdünnen Sie das Fluorophor vor jedem Eingriff in 1x Amplifikationsverdünnungsmittel bei 1:100. Entsorgen Sie alle nicht verwendeten Teile der Fluorophor-Arbeitslösung.</li>
		<li>Fluorophor 780 Arbeitslösung: Rekonstituieren Sie TSA-DIG in 75 μl DMSO und das Fluorophorpulver 780 in 300 μl doppelt destilliertem Wasser. Vor dem Eingriff TSA-DIG in 1x Amplifikationsverdünnungsmittel bei 1:100 und Fluorophor 780 mit Ab-Verdünnungsmittel bei 1:25 verdünnen.</li>
		<li>DAPI-Arbeitslösung: Verdünnen Sie die DAPI-Lösung bei 1:50 mit doppelt destilliertem Wasser oder PBS. Vor Gebrauch vorbereiten und bei 4 °C nicht länger als 48 h lagern. ANMERKUNG. Waschen Sie die Objektträger während dieses Multilabel-Fluoreszenzfärbeexperiments nur mit doppelt destilliertem Wasser und frisch zubereiteter Waschpuffer-Arbeitslösung. Gewebeschnitte dürfen nicht mit Leitungswasser in Berührung kommen; Verunreinigungen im Leitungswasser können an den Gewebeschnitten haften bleiben und Autofluoreszenz verursachen. Halten Sie die Proben während des gesamten Experiments von Licht fern.</li>
	</ol></li>
	<li>Antigen-Rückgewinnung<ol><li>Legen Sie die Objektträger in eine Färbe- und Reparaturbox und füllen Sie sie mit PH6- oder PH9-Pufferarbeitslösung, decken Sie sie mit dem Deckel ab und erhitzen Sie sie 2 x 8 Minuten lang in der Mikrowelle bei 100 % Leistung. Anmerkungen: Geben Sie während des Erhitzungsvorgangs doppelt destilliertes Wasser in die Reparaturbox, um eine übermäßige Verdunstung zu verhindern, die zum Austrocknen der Scheiben führen kann.</li>
		<li>Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie fortfahren (30-60 min).</li>
		<li>Waschen Sie die Objektträger 3 x 2 min mit doppelt destilliertem Wasser. Verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um den Gewebeabschnitt auf dem Objektträger zu umschließen.</li>
	</ol></li>
	<li>Blockierend<ol><li>Tauchen Sie die Gewebeschnitte in Waschpuffer, bedecken Sie sie mit Blockierungslösung und inkubieren Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur für 10 Minuten.</li>
	</ol></li>
	<li>Inkubation von primären Antikörpern<ol><li>Entfernen Sie die Blockierungslösung von den Objektträgern und bedecken Sie die Gewebeschnitte mit der primären Antikörper-Arbeitslösung. Inkubieren Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer für 1 h bei 37 °C im Inkubator oder über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank. HINWEIS: Lassen Sie die Objektträger nicht austrocknen.</li>
	</ol></li>
	<li>Einführung von Polymer HRP<ol><li>Waschen Sie die Objektträger 3 x 2 Minuten lang in Waschpuffer-Arbeitslösung. Geben Sie Polymer HRP direkt tropfenweise in die Gewebeschnitte und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. HINWEIS: Im Kühlschrank aufbewahrte Objektträger vor dem Waschen ca. 30 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahren, um den primären Antikörper zu entfernen.</li>
	</ol></li>
	<li>Erzeugung von Tyramin-Signalverstärkung (TSA)<ol><li>Waschen Sie den Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit Waschpuffer-Arbeitslösung, geben Sie die Fluorophor-Arbeitslösung direkt tropfenweise in die Gewebeschnitte und inkubieren Sie ihn 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit Waschpuffer-Arbeitslösung.</li>
	</ol></li>
	<li>Spezielles Verfahren für Fluorophor 780 HINWEIS: Fluorophor 780 ist schwach und wird routinemäßig an letzter Stelle im Farbanpassungsschema des gesamten Experiments platziert. Fluorophor 780 wird normalerweise nicht in diesem Versuchsprotokoll verwendet, aber aufgrund seiner Spezifität werden seine experimentellen Schritte aufgeführt.<ol><li>Einführung von TSA-DIG<ol><li>Waschen Sie den Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit Waschpuffer-Arbeitslösung, geben Sie die TSA-Drg-Arbeitslösung tropfenweise in die Gewebeschnitte und inkubieren Sie ihn 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.</li>
		</ol></li>
		<li>Mikrowellen-Behandlung<ol><li>Waschen Sie die Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit Waschpuffer-Arbeitslösung.</li>
			<li>Legen Sie die Objektträger in eine Färbe- und Reparaturbox, füllen Sie sie mit Reparaturlösung, decken Sie sie mit dem Deckel ab und erhitzen Sie sie 2 x 8 Minuten lang in der Mikrowelle bei 100 % Leistung. Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie fortfahren (30-60 min).</li>
			<li>Waschen Sie die Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser.</li>
		</ol></li>
		<li>Signalerzeugung mit Fluorophor 780<ol><li>Tauchen Sie die Schnitte in Waschpuffer, bedecken Sie sie mit der Arbeitslösung Fluorophor 780 und inkubieren Sie die Objektträger 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer.</li>
			<li>Waschen Sie die Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit Waschpuffer-Arbeitslösung. HINWEIS: Führen Sie nach diesem Schritt keine Mikrowellenbehandlung durch.</li>
		</ol></li>
		<li>Verwenden Sie Fluorophor 780 als letzten Schritt des gesamten Arbeitsablaufs und färben Sie die Kerne dann direkt mit der DAPI-Arbeitslösung. HINWEIS: Überspringen Sie Schritt 3.7, wenn Sie kein Fluorophor 780 verwenden.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikrowellen-Behandlung HINWEIS: Dieser Mikrowellenschritt entfernt den primär-sekundären HRP-Komplex und setzt Antigene erneut frei, was die Einführung des nächsten primären Antikörpers ermöglicht.<ol><li>Legen Sie die Objektträger in eine Färbe- und Reparaturbox, füllen Sie sie mit PH6- oder PH9-Pufferarbeitslösung, decken Sie sie mit dem Deckel ab und erhitzen Sie sie 2 x 8 Minuten lang in der Mikrowelle bei 100 % Leistung.</li>
		<li>Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie fortfahren (30-60 min). Waschen Sie die Objektträger 3 x 1 min mit doppelt destilliertem Wasser.</li>
		<li>Tauchen Sie die Objektträger 2 Minuten lang in die Arbeitslösung des Waschpuffers. Führen Sie die nächste Antikörperinkubation durch.</li>
	</ol></li>
	<li>Nächste Antikörper-Inkubation<ol><li>Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.8 (außer Schritt 3.7).</li>
	</ol></li>
	<li>Zellkernfärbung und Gewebeversiegelung<ol><li>Decken Sie die Gewebeschnitte mit der DAPI-Arbeitslösung ab und inkubieren Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser.</li>
		<li>Entfernen Sie Wassertropfen von den Objektträgern, fügen Sie jedem Objektträger 10-20 μl Anti-Fluoreszenz-Quencher hinzu und versiegeln Sie die Objektträger mit einem Mikroskop-Deckglas.</li>
		<li>Lagern Sie die fertigen Objektträger bei 4 °C lichtgeschützt länger als 1 Monat. HINWEIS: Achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Richten Sie die Negativkontrolle ein
<ol><li>Verarbeiten Sie die Negativkontrollobjektträger wie die gewebehaltigen Objektträger, jedoch ohne Zusatz von Reagenzien wie Primärantikörpern, Sekundärantikörpern, TSA-Reagenzien und DAPI, die zum Entfernen der Gewebeautofluoreszenz beim Scannen des Films verwendet werden.</li>
</ol>5. Vollautomatisches Scannen von Gewebeobjektträgern
HINWEIS: Das für die spektrale Bildgebung verwendete Gerät ist ein vollautomatischer multispektraler Gewebequantifizierungsanalysator, und die Bildgebung und Analysevisualisierung von 5-Farben-Objektträgern kann mit dem referenzierten System durchgeführt werden (siehe Materialtabelle). Das System verwendet multispektrale Bildgebung zur quantitativen Entmischung mehrerer Fluorophore und Gewebeautofluoreszenz.
<ol><li>Stellen Sie die Belichtungszeit und das Scanprogramm für jeden Fluoreszenzkanal manuell ein und bestätigen Sie, dass das Gerät die vollautomatische Belichtung und das Scannen der Gewebeobjektträger abgeschlossen hat. HINWEIS: Die Objektträgeroberfläche muss sauber und frei von Wasserfilm sein. Seien Sie vorsichtig mit der Menge an Versiegelung: Zu viel führt dazu, dass das Deckglas verrutscht und das Instrument einen Fehler meldet.</li>
</ol>6. Analyse der Fluoreszenz
<ol><li>Doppelklicken Sie auf die Software (siehe Materialtabelle), ziehen Sie die mehrfarbige Fluoreszenzbilddatei aus dem Originalscan in die Software und stellen Sie den Bildtyp auf Fluoreszenz ein.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Helligkeit und Kontrast und überprüfen Sie die Kanäle auf dem Bedienfeld. Klicken Sie nach außen und dann auf den Kanal , um den gewünschten Fluoreszenzkanal auszuwählen. Ziehen Sie die Min-Anzeige und die Max-Anzeige , um die Helligkeit und den Kontrast der einzelnen Kanäle anzupassen.</li>
	<li>Bestimmen Sie nach der Analyse die zu speichernde Ansicht, klicken Sie auf Folienübersicht anzeigen und Cursorposition anzeigen , um diese beiden Inhalte zu entfernen, behalten Sie die Maßstabsleiste bei und klicken Sie auf Datei | Snapshot exportieren | Aktueller Viewer-Inhalt zum Exportieren einer PNG-Datei. HINWEIS: Jeder Fluoreszenzkanal und eine zusammengeführte Abbildung müssen für zukünftige Analysen exportiert werden.</li>
	<li>Zur weiteren Analyse der Zielzellpositivität verwenden Sie die Zellidentifikations- und Segmentierungssoftware21 (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>

Entschlüsselung der Tumormikroumgebung mit mIHC beim Plattenepithelkarzinom der Lunge

<ol>
	<li>Zaidi, A. U., Enomoto, H., Milbrandt, J., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+fluorescent+in+situ+hybridization+and+immunohistochemical+detection+with+tyramide+signal+amplification.">Dual fluorescent in situ hybridization and immunohistochemical detection with tyramide signal amplification.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (10), 1369-1375 (2000).</li><li>Lovisa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+induces+cell+cycle+arrest+and+parenchymal+damage+in+renal+fibrosis.">Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis.</a> Nature Medicine. 21 (9), 998-1009 (2015).</li><li>Nghiem, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+blockade+with+pembrolizumab+in+advanced+Merkel-cell+carcinoma.">PD-1 blockade with pembrolizumab in advanced Merkel-cell carcinoma.</a> The New England Journal of Medicine. 374 (26), 2542-2552 (2016).</li><li>Zaretsky, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+associated+with+acquired+resistance+to+PD-1+blockade+in+melanoma.">Mutations associated with acquired resistance to PD-1 blockade in melanoma.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (9), 819-829 (2016).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heterogeneous+immune+landscape+between+lung+adenocarcinoma+and+squamous+carcinoma+revealed+by+single-cell+RNA+sequencing.">The heterogeneous immune landscape between lung adenocarcinoma and squamous carcinoma revealed by single-cell RNA sequencing.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 289 (2022).</li><li>Becheva, Z. R., Gabrovska, K. I., Godjevargova, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+direct+and+indirect+immunofluorescence+method+for+determination+of+somatic+cell+count.">Comparison between direct and indirect immunofluorescence method for determination of somatic cell count.</a> Chemical Papers. 72, 1861-1867 (2018).</li><li>Niedenberger, B. A., Geyer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+immunostaining+approaches+to+study+early+male+germ+cell+development.">Advanced immunostaining approaches to study early male germ cell development.</a> Stem Cell Research. 27, 162-168 (2018).</li><li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim-3+expression+on+tumor-infiltrating+PD-1+CD8++T+cells+correlates+with+poor+clinical+outcome+in+renal+cell+carcinoma.">Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li><li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1-expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Meany, D. L., Hackler, L., Zhang, H., Chan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+antibody-overlay+lectin+microarray:+a+strategy+to+improve+the+sensitivity+of+targeted+glycan+profiling.">Tyramide signal amplification for antibody-overlay lectin microarray: a strategy to improve the sensitivity of targeted glycan profiling.</a> Journal of Proteome Research. 10 (3), 1425-1431 (2011).</li><li>Surace, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multiplex+immunofluorescence+panel+for+immuno-oncology+studies+on+formalin-fixed+carcinoma+tissue+specimens.">Automated multiplex immunofluorescence panel for immuno-oncology studies on formalin-fixed carcinoma tissue specimens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), 58390 (2019).</li><li>Lazarus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization,+design+and+avoiding+pitfalls+in+manual+multiplex+fluorescent+immunohistochemistry.">Optimization, design and avoiding pitfalls in manual multiplex fluorescent immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), 59915 (2019).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Mansfield, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging:+a+review+of+its+technical+aspects+and+applications+in+anatomic+pathology.">Multispectral imaging: a review of its technical aspects and applications in anatomic pathology.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 185-210 (2014).</li><li>Gustavson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+unsupervised+pixel-based+clustering+algorithm+for+compartmentalization+of+immunohistochemical+expression+using+Automated+QUantitative+Analysis.">Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated QUantitative Analysis.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).</li><li>Lu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biomarker+modalities+for+predicting+response+to+PD-1/PD-L1+checkpoint+blockade:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis.</a> JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).</li><li>Humphries, M. P., Maxwell, P., Salto-Tellez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QuPath:+The+global+impact+of+an+open+source+digital+pathology+system.">QuPath: The global impact of an open source digital pathology system.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 852-859 (2021).</li><li>Bankhead, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QuPath:+Open+source+software+for+digital+pathology+image+analysis.">QuPath: Open source software for digital pathology image analysis.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16878 (2017).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4,+Experimental+Pathology+Techniques+of+Respiratory+System.">Chapter 4, Experimental Pathology Techniques of Respiratory System.</a> Atlas of Experimental Pathology Techniques. , 125-126 (2012).</li><li>Wilson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+in+the+statistical+analysis+of+multiplex+immunofluorescence+data.">Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data.</a> Cancers. 13 (12), 3031 (2021).</li><li>Mori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+tumor+immune+microenvironment+with+Tyramide-based+multiplex+immunofluorescence.">Characterizing the tumor immune microenvironment with Tyramide-based multiplex immunofluorescence.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 417-432 (2020).</li><li>Mansfield, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+context+in+epigenetics:+quantitative+multicolor+imaging+and+automated+per-cell+analysis+of+miRNAs+and+their+putative+targets.">Cellular context in epigenetics: quantitative multicolor imaging and automated per-cell analysis of miRNAs and their putative targets.</a> Methods. 52 (4), 271-280 (2010).</li></ol>

Alle Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte gibt.

mIHC ist eine unverzichtbare experimentelle Technik im Bereich der wissenschaftlichen Forschung für die quantitative und räumliche Analyse mehrerer Proteinmarker auf Einzelzellebene in einem einzigen Gewebeschnitt, die intuitive und genaue Daten für die Untersuchung der Krankheitspathologie liefert, indem sie sich auf die detaillierte Gewebestruktur und die zellulären Interaktionen im Kontext des ursprünglichen Gewebes konzentriert. Die weit verbreitete Einführung der mIHC-Technologie erfordert optimierte und effek...

Die mehr als 20-jährige Tyramin-Signalamplifikation (TSA) ist eine Klasse von Assay-Techniken, die Meerrettichperoxidase (HRP) für die In-situ-Markierung von Zielantigenen mit hoher Dichte verwenden und in enzymgebundenen Immunosorbent-Assays (ELISAs), In-situ-Hybridisierung (ISH), Immunhistochemie (IHC) und anderen Techniken zum Nachweis biologischer Antigene weit verbreitet sind. Erhebliche Verbesserung der Empfindlichkeit des detektierten Signals1. Die polychromatische Opalfärbung auf Basis der TSA-Technologie wurde kürzlich entwickelt und in mehreren Studien weit verbreitet 2,3,4,5. Die traditionelle Immunfluoreszenzfärbung (IF) bietet Forschern ein einfaches Werkzeug zum Nachweis und Vergleich der Verteilung von Proteinen in den Zellen und Geweben verschiedener Modellorganismen. Es basiert auf einer Antikörper-/Antigen-spezifischen Bindung und umfasst direkte und indirekte Ansätze6. Bei der direkten Immunfärbung wird ein Fluorophor-konjugierter Primärantikörper gegen das interessierende Antigen verwendet, was eine direkte Fluoreszenzdetektion mit einem Fluoreszenzmikroskop ermöglicht. Der indirekte Immunfärbeansatz beinhaltet die Anwendung eines Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpers gegen den nicht konjugierten Primärantikörper 6,7.
Herkömmliche Immunfluoreszenz-Färbemethoden können nur ein, zwei oder in einigen Fällen drei Antigene in Geweben färben, was eine große Einschränkung bei der Gewinnung der reichhaltigen Informationen in Gewebeschnitten darstellt. Die Interpretation quantitativer Ergebnisse hängt oft von visueller Beobachtung und genauer Quantifizierung durch Bildgebungssoftware wie ImageJ ab. Es gibt technische Einschränkungen, wie z. B. die Einschränkung der Antikörperspezies, schwache fluoreszierende Markierungssignale und die Farbüberlappung von Fluoreszenzfarbstoffen (Tabelle 1). Die Opal-Multiplex-IHC-Technik (mIHC) basiert auf der TSA-Ableitung, die die Multiplex-Färbung und differentielle Markierung von mehr als 7-9 Antigenen auf demselben Gewebeschnitt ohne Einschränkung der Herkunft des Primärantikörpers ermöglicht, aber eine hohe Spezifität des entsprechenden Antikörpers gegen das Antigen erfordert. Das Färbeverfahren ähnelt dem der normalen Immunfluoreszenzfärbung, mit zwei Unterschieden: Bei jeder Färberunde wird nur ein Antikörper verwendet und ein Antikörper-Elutionsschritt hinzugefügt. Antikörper, die durch nichtkovalente Bindungen an das Antigen gebunden sind, können durch Mikrowellenelution entfernt werden, aber das TSA-Fluoreszenzsignal, das durch kovalente Bindungen an die Oberfläche des Antigens gebunden ist, bleibt erhalten.
Aktivierte Tyramin (T)-Moleküle, die mit dem Farbstoff markiert sind, sind am Zielantigen stark angereichert, was eine effiziente Verstärkung des Fluoreszenzsignals ermöglicht. Dies ermöglicht die direkte Markierung des Antigens ohne Antikörperinterferenz, und dann kann nach mehreren Färbezyklen eine mehrfarbige Markierung erreicht werden 8,9,10 (Abbildung 1). Obwohl diese Technologie zuverlässige und genaue Bilder für die Untersuchung von Krankheiten liefert, kann die Erstellung einer nützlichen Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie (mfIHC)-Färbestrategie aufgrund der Notwendigkeit umfangreicher Optimierungen und Designs zeitaufwändig und anspruchsvoll sein. Daher wurde dieses Multiplex-Panel-Protokoll in einem automatisierten IHC-Färbegerät mit einer kürzeren Färbezeit als das manuelle Protokoll optimiert. Dieser Ansatz kann von jedem Forscher für immunonkologische Studien an humanen formalinfixierten und paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeproben direkt angewendet und angepasst werden11. Darüber hinaus werden die Methoden zur Objektträgervorbereitung, Antikörperoptimierung und Multiplex-Design hilfreich sein, um robuste Bilder zu erhalten, die genaue zelluläre Interaktionen in situ darstellen, und um die Optimierungszeit für die manuelle Analyse zu verkürzen12.
Das mfIHC umfasst hauptsächlich die Bilderfassung und Datenanalyse. In Bezug auf die Bildaufnahme müssen mehrfarbig markierte, komplex gefärbte Proben mit professionellen spektralen Bildgebungsgeräten detektiert werden, um die verschiedenen gemischten Farbsignale zu identifizieren und Bilder mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis ohne Störungen durch Gewebeautofluoreszenz zu erhalten. Zu den aktuellen Geräten für die spektrale Bildgebung gehören hauptsächlich spektrale konfokale Mikroskope und multispektrale Gewebebildgebungssysteme. Das multispektrale Gewebebildgebungssystem ist ein professionelles Bildgebungssystem, das für die quantitative Analyse von Gewebeschnitten entwickelt wurde, und sein wichtigstes Merkmal ist die Erfassung von Bildspektralinformationen, die sowohl morphologische Struktur- als auch optische Kartierungsinformationen biologischer Gewebeproben liefern13,14. Jedes Pixel im Spektralbild enthält eine vollständige Spektralkurve, und jeder Farbstoff (einschließlich Autofluoreszenz) hat sein entsprechendes charakteristisches Spektrum, das die vollständige Aufzeichnung und genaue Identifizierung von gemischten und überlappenden Multilabel-Signalen ermöglicht.
In Bezug auf die Datenanalyse sind mehrfarbig markierte Proben aufgrund der morphologischen Struktur und der Bestandteile der Gewebeproben äußerst komplex. Gewöhnliche Software kann verschiedene Gewebetypen nicht automatisch identifizieren. Daher wird eine intelligente quantitative Gewebeanalysesoftware für die quantitative Analyse der Antigenexpression in bestimmten Regionen verwendet 15,16,17,18.
Vor allem hat die Multilabel-Immunfluoreszenzfärbung in Kombination mit multispektraler Bildgebung und quantitativer Pathologie-Analysetechnologie die Vorteile einer großen Anzahl von Nachweiszielen, einer effektiven Färbung und einer genauen Analyse und kann daher die Genauigkeit der histomorphologischen Analyse erheblich verbessern, die räumliche Beziehung zwischen Proteinen mit zellulärer Auflösung aufdecken und dazu beitragen, reichhaltigere und zuverlässigere Informationen aus Gewebeschnittproben zu gewinnen19 (Tabelle 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab237709</td>
			<td>Primary antibody, 1/100, PH9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD68</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab955</td>
			<td>Primary antibody, 1/300, PH9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CK5/6</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1620</td>
			<td>Primary antibody, 1/150, PH9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HMGCS1</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX112346</td>
			<td>Primary antibody, 1/300, PH6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal nonimmune serum</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>SP KIT-B3</td>
			<td>Antigen blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluormount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Anti-fluorescent burst</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit</td>
			<td>Akoya</td>
			<td>NEL861001KT</td>
			<td>Opal mIHC Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K8000/K8002/K8007/K8023</td>
			<td>Washing the tissues slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>intelligent quantitative tissue analysis software, paid software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>intelligent quantitative tissue analysis software, paid software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Vectra</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuPath 0.3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex immunohistochemistry staining for paraffin-embedded lung cancer tissue

Lungenkrebs ist weltweit die Hauptursache für bösartige tumorbedingte Morbidität und Mortalität, und die komplexe Tumormikroumgebung gilt als die häufigste Todesursache bei Lungenkrebspatienten. Die Komplexität der Tumormikroumgebung erfordert effektive Methoden, um Zell-Zell-Beziehungen in Tumorgeweben zu verstehen. Die Multiplex-Immunhistochemie (mIHC)-Technik ist zu einem Schlüsselwerkzeug geworden, um die Beziehung zwischen der Expression von Proteinen vor und hinter Signalwegen in Tumorgeweben abzuleiten und klinische Diagnosen und Behandlungspläne zu entwickeln. mIHC ist eine Multi-Label-Immunfluoreszenz-Färbemethode, die auf der Tyramine Signal Amplification (TSA)-Technologie basiert und mehrere Zielmoleküle gleichzeitig auf derselben Gewebeschnittprobe nachweisen kann, um unterschiedliche Protein-Co-Expressions- und Co-Lokalisierungsanalysen zu erreichen. In diesem experimentellen Protokoll wurden paraffineingebettete Gewebeschnitte von Lungenplattenepithelkarzinomen klinischen Ursprungs einer immunhistochemischen Multiplex-Färbung unterzogen. Durch die Optimierung des experimentellen Protokolls wurde eine immunhistochemische Multiplex-Färbung von markierten Zielzellen und Proteinen erreicht, wodurch das Problem der Autofluoreszenz und des Kanalwechsels im Lungengewebe gelöst wurde. Darüber hinaus wird die immunhistochemische Multiplex-Färbung häufig bei der experimentellen Validierung von tumorbezogenen Hochdurchsatzsequenzierungen, einschließlich Einzelzellsequenzierung, Proteomik und Geweberaumsequenzierung, eingesetzt und liefert intuitive und visuelle Validierungsergebnisse für die Pathologie.

Tyramine signal amplification (TSA), which has a history of more than 20 years, is a class of assay techniques that use horseradish peroxidase (HRP) for high-density in situ labeling of target antigens and is widely applied in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), in situ hybridization (ISH), immunohistochemistry (IHC), and other techniques for the detection of biological antigens, substantially improving the sensitivity of the detected signal1. Opal polychromatic staining based on TSA technology has been recently developed and widely used in several studies2,3,4,5. Traditional immunofluorescence (IF) staining provides researchers with an easy tool for the detection and comparison of the distribution of proteins in the cells and tissues of various model organisms. It is based on antibody-/antigen-specific binding and includes direct and indirect approaches6. Direct immunostaining involves the use of a fluorophore-conjugated primary antibody against the antigen of interest, which enables direct fluorescent detection using a fluorescence microscope. The indirect immunostaining approach involves the application of a fluorophore-conjugated secondary antibody against the unconjugated primary antibody6,7.
Traditional, single-label, immunofluorescence staining methods can stain only one, two, or in some cases, three antigens in tissues, which is a major limitation in mining the rich information contained in tissue sections. The interpretation of quantitative results often depends on visual observation and accurate quantification by imaging software, such as ImageJ. There are technical limitations, such as antibody species restriction, weak fluorescent label signals, and fluorescent dye color overlap (Table 1). The Opal multiplex IHC (mIHC) technique is based on TSA derivation, which allows multiplex staining and differential labeling of more than 7-9 antigens on the same tissue section, with no restriction on the origin of the primary antibody, but requires high specificity of the corresponding antibody against the antigen. The staining procedure is similar to that of normal immunofluorescence staining, except for two differences: each round of staining involves the use of only one antibody and an antibody elution step is added. Antibodies bound to the antigen by noncovalent bonds can be removed by microwave elution, but the TSA fluorescent signal bound to the surface of the antigen by covalent bonds is retained.
Activated tyramine (T) molecules labeled with the dye are highly enriched at the target antigen, allowing efficient amplification of the fluorescent signal. This allows direct labeling of the antigen without antibody interference, and then multicolor labeling can be achieved after multiple staining cycles8,9,10 (Figure 1). Although this technology produces reliable and accurate images for the study of disease, the creation of a useful multiplex fluorescent immunohistochemistry (mfIHC) staining strategy can be time-consuming and exacting due to the need for extensive optimization and design. Therefore, this multiplex panel protocol has been optimized in an automated IHC stainer with a shorter staining time than that of the manual protocol. This approach can be directly applied and adapted by any researcher for immuno-oncology studies on human formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue samples11. Moreover, the methods for slide preparation, antibody optimization, and multiplex design will be helpful in obtaining robust images that represent accurate cellular interactions in situ and to shorten the optimization period for manual analysis12.
The mfIHC mainly includes image acquisition and data analysis. In terms of image acquisition, multicolor-labeled complex-stained samples need to be detected with professional spectral imaging equipment to identify the various mixed color signals and obtain high signal-to-noise images without interference from tissue autofluorescence. Current equipment for spectral imaging mainly includes spectral confocal microscopes and multispectral tissue imaging systems. The multispectral tissue imaging system is a professional imaging system designed for the quantitative analysis of tissue sections, and its most important feature is the acquisition of image spectral information, which provides both morphological structure and optical mapping information of biological tissue samples13,14. Any pixel in the spectral image contains a complete spectral curve, and each dye (including autofluorescence) has its corresponding characteristic spectrum, which enables the complete recording and accurate identification of mixed and overlapping multilabel signals.
In terms of data analysis, multicolor-labeled samples are extremely complex due to the morphological structure and constituent cells of the tissue samples. Ordinary software cannot automatically identify different tissue types. Hence, intelligent quantitative tissue analysis software is used for quantitative analysis of antigen expression in specific regions15,16,17,18.
Above all, multilabel immunofluorescence staining fused with multispectral imaging and quantitative pathology analysis technology has the advantages of a large number of detection targets, effective staining, and accurate analysis, and it can therefore significantly improve the accuracy of histomorphological analysis, reveal the spatial relationship between proteins with cellular-level resolution, and help to mine richer and more reliable information from tissue section samples19 (Table 1).

Autor im Rampenlicht: Verbesserung der mehrfarbigen Fluoreszenzlokalisierung in Lungenkarzinomproben

Multiplex-Immunhistochemie-Färbung für paraffineingebettetes Lungenkrebsgewebe

Our research focused on optimizing the mIHC protocol on paraffin section obtained from clinic sources. We aimed to effectively address autofluorescence and autofluorescence channel crosstalk issues in lung tissue. The current experimental challenges we are facing involve addressing the issues of autofluorescence and channel crosstalk in lung tissue, whereby achieving successful multicolor fluorescence localization they need for labeled target cells and proteins.Our highly efficient multiple antigen in situ labeling method, which requires less than three hours per antibody, seamlessly integrates a multispectral imaging system and a specialized pathology software. This optimized mIHC protocol is easily adaptable for use in other research laboratories.

Wir haben das Matching-Schema von CD8-Primärantikörpern und Fluorophoren optimiert. Beide Sätze von Fluoreszenzergebnissen entsprachen genau den gleichen Antikörper-Inkubationsbedingungen in der Versuchsgruppe, mit Ausnahme der Änderung des Antikörper-angepassten Fluorophors. Wie in Abbildung 2 gezeigt, gab es einen signifikanten Unterschied in der Kanalanpassung von CD8+ T-Zellen mit Fluorophor 480 und Fluorophor 690. Der Kanal mit Fluorophor 690 zeigt einen extrem starken fluoreszier...

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Dieses experimentelle Protokoll beschreibt und optimiert eine Multiplex-Immunhistochemie (IHC)-Färbemethode, hauptsächlich durch die Optimierung der Inkubationsbedingungen von Einzelkanal-Antikörpern und die Anpassung der Einstellungen von Antikörpern und Kanälen, um die Probleme der Autofluoreszenz und des Kanalwechsels in Lungenkrebsgeweben klinischen Ursprungs zu lösen.

Lung cancer is the leading cause of malignant tumor-related morbidity and mortality all over the world, and the complex tumor microenvironment has been ...

Unsere Forschung konzentrierte sich auf die Optimierung des mIHC-Protokolls für Paraffinschnitte aus klinischen Quellen. Unser Ziel war es, Probleme mit Autofluoreszenz und Autofluoreszenzkanal-Crosstalk im Lungengewebe effektiv anzugehen. Die aktuellen experimentellen Herausforderungen, mit denen wir konfrontiert sind, umfassen die Behandlung der Probleme der Autofluoreszenz und des Kanalwechsels im Lungengewebe, wobei eine erfolgreiche mehrfarbige Fluoreszenzlokalisierung für markierte Zielzellen und Proteine erforderlich ist.Unsere hocheffiziente In-situ-Markierungsmethode für mehrere Antigene, die weniger als drei Stunden pro Antikörper benötigt, integriert nahtlos ein multispektrales Bildgebungssystem und eine spezialisierte Pathologiesoftware. Dieses optimierte mIHC-Protokoll lässt sich leicht für den Einsatz in anderen Forschungslabors anpassen.

multiplex-immunohistochemistry-staining-for-paraffin-embedded-lung

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Multiplex Immunohistochemistry Staining for Paraffin-embedded Lung Cancer Tissue

1.2K Aufrufe.  Sichuan University. Unsere Forschung konzentrierte sich auf die Optimierung des mIHC-Protokolls für Paraffinschnitte aus klinischen Quellen. Unser Ziel war es, Probleme mit Autofluoreszenz und Autofluoreszenzkanal-Crosstalk im Lungengewebe effektiv anzugehen. Die aktuellen experimentellen Herausforderungen, mit denen wir konfrontiert sind, umfassen die Behandlung der Probleme der Autofluoreszenz und des Kanalwechsels im Lungengewebe, wobei eine erfolgreiche mehrfarbige Fluoreszenzlokalisierung für markierte Zi...

Serie: Autor im Rampenlicht: Verbesserung der mehrfarbigen Fluoreszenzlokalisierung in Lungenkarzinomproben

Lung cancer is the leading cause of malignant tumor-related morbidity and mortality all over the world, and the complex tumor microenvironment has been considered the leading cause of death in lung cancer patients. The complexity of the tumor microenvironment requires effective methods to understand cell-to-cell relationships in tumor tissues. The multiplex immunohistochemistry (mIHC) technique has become a key tool for inferring the relationship between the expression of proteins upstream and downstream of signaling pathways in tumor tissues and developing clinical diagnoses and treatment plans. mIHC is a multi-label immunofluorescence staining method based on Tyramine Signal Amplification (TSA) technology, which can simultaneously detect multiple target molecules on the same tissue section sample to achieve different protein co-expression and co-localization analysis. In this experimental protocol, paraffin-embedded tissue sections of lung squamous carcinoma of clinical origin were subjected to multiplex immunohistochemical staining. By optimizing the experimental protocol, multiplex immunohistochemical staining of labeled target cells and proteins was achieved, solving the problem of autofluorescence and channel crosstalk in lung tissues. In addition, multiplex immunohistochemical staining is widely used in the experimental validation of tumor-related, high-throughput sequencing, including single-cell sequencing, proteomics, and tissue space sequencing, providing intuitive and visual pathology validation results.

This experimental protocol describes and optimizes a multiplex immunohistochemistry (IHC) staining method, mainly by optimizing single-channel antibody incubation conditions and adjusting the settings of antibodies and channels to solve the problems of autofluorescence and channel crosstalk in lung cancer tissues of clinical origin.

Forschung

Krebsforschung

Optimizing Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Staining for Lung Cancer Tissue Samples to Address Autofluorescence Issues

To begin, obtain previously prepared formula and fixed and paraffin embedded lung cancer tissue sample slide. Incubate it at 65 degrees Celsius for five minutes. Perform dehydration by immersing the slide in xylene, followed by ethanol solutions of decreasing concentrations.Then immerse the slides in sterilized water three times for one minute each. For antigen retrieval, place the slide in a staining and repair box. Fill it with immunohistochemical antigen repair buffer working solution of pH six or nine.Cover the box with a lid, and heat it in a microwave oven for eight minutes at 100%power. Then cool the slide to room temperature. Cover the tissue with a blocking solution, and then incubate in a humidified chamber at room temperature for 10 minutes.After removing the blocking solution, cover the slide with the primary antibody working solution, and place it in a humidified chamber. Then incubate this chamber for one hour at 37 degrees Celsius. Next, wash the slide with wash buffer working solution for two minutes.Add polymer horseradish peroxidase directly dropwise onto the slide, and incubate it for 15 minutes at room temperature. After washing the slide, add fluorophore working solution directly dropwise onto the slide, and incubate it for 10 minutes at room temperature. Once the slide is washed, give microwave treatment as demonstrated previously.When the slide is cooled to room temperature, wash it three times with double distilled water for one minute each. Next, dip the slide in the wash buffer working solution for two minutes, and perform antibody incubation, horseradish peroxidase, and fluorophore addition as demonstrated. For cell nuclear staining, cover the slide with DAPI working solution and incubate it in a humidified chamber for five minutes at room temperature.Then wash the slides with double distilled water three times, one minute each. Remove water droplets from the slide. Add 10 to 20 microliters of anti-fluorescence quencher to the slide, and seal it with a microscope cover glass.

Optimierung der Multiplex-Immunhistochemie (mIHC)-Färbung für Lungenkrebsgewebeproben zur Behandlung von Autofluoreszenzproblemen

Analyzing Fluorescence in Lung Cancer Tissue Samples Stained with Optimized Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Technique

To begin, obtain previously prepared stained lung cancer tissue sample slides. For automatic scanning of the stained slides, manually set the exposure time and scanning program for each fluorescence channel. Drag the multicolor fluorescence image file obtained from the original scan into the software and set the image type to fluorescence.Click the brightness and contrast button and check the channels on the panel. Click outside and then on the channel to select the fluorescence channel of interest. Drag the minimum display and maximum display to adjust the brightness and contrast of each channel.Once the view to be saved is determined, click on show slide overview and show cursor location to remove these two contents and keep the scale bar. Click file followed by export snapshot and current viewer content To export a PNG file. The non-small cell lung squamous carcinoma tissues showed that macrophages and CD eight positive T-cells significantly infiltrated around and within carcinoma foci.HMGCS1 protein exhibited widespread expression in squamous carcinoma cell plasma.