Diese Arbeit wurde finanziert von der National Natural Science Foundation of China (82130113), der National Natural Science Foundation of China (82204765), der Nature Science Foundation of Sichuan (2022NSFSC1470), dem Sichuan Provincial Postdoctoral Special Funding Project (TB2023020) und dem Xinglin Scholars Research Promotion Program der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (BSH2021030). Mit diesen Mitteln werden Experimentiergeräte, experimentelle Materialien und Publikationsgebühren unterstützt.

1. Vorbereitung
<ol><li>Vorbereitung der Probe<ol><li>Verwenden Sie eine Sensitivitätswaage von 1/10.000, um 0,25 g (Trockengewicht) APB in ein 3-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu wiegen, fügen Sie 2,5 mL Methanol hinzu und beschallen Sie es dann 30 Minuten lang (Leistung 240 W, Frequenz 40 kHz).</li>
		<li>Führen Sie eine Zentrifugation bei 1,2 x g für 5 min durch, sammeln Sie den Überstand und filtrieren Sie durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm.</li>
	</ol></li>
	<li>Aufbereitung von Versuchsmaterialien<ol><li>Bereiten Sie die zweidimensionale mobile Phase vor, verwenden Sie Acetonitril als organische Phase B und konfigurieren Sie 0,1 % Ameisensäure Reinstwasser als wässrige Phase A.</li>
		<li>Führen Sie eine zweiphasige Filtration (0,22 μm) durch und beschallen Sie sie 15 Minuten lang mit einem Ultraschallgerät (40 kHz). Spülen Sie die ersetzte mobile Phase, um die Blasen zu entfernen. In diesem Experiment wurde die C18-Säule als 1D-Säule verwendet, die hydrophile Säule als 2D-Säule und die Säule wurde am Instrument montiert.</li>
	</ol></li>
	<li>Einstellung des passenden Shunt-Verhältnisses<ol><li>Verbinden Sie die 2D-LC-Instrumentenausgangsleitung durch ein T-Stück mit dem Masseneinlass und das andere Ende des T-Stücks mit einer Nebenrangleitung. Stellen Sie die Flussrate auf einen geeigneten Wert ein, um sicherzustellen, dass die Flussrate in das Massenspektrum 0,3-0,5 mL/min beträgt. HINWEIS: Da die zweite Dimension des 2D-LC in der Regel über 2 mL/min eingestellt ist, ist diese Durchflussrate für MS zu groß, so dass eine Teilung erforderlich ist.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 2D-LC-Betrieb
<ol><li>Doppelklicken Sie auf das Symbol Instrument 1 Online , und die chemische Workstation kommuniziert automatisch mit dem 1260 LC und betritt die Workstation.</li>
	<li>Wählen Sie für die Einstellung der 2D-LC-Methodenparameter den Bildschirm Methoden- und Ausführungssteuerung aus dem Menü Ansicht aus, um die gewünschte Schnittstelle aufzurufen, die normalerweise standardmäßig eingegeben wird. Klicken Sie auf das Injektormodul, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Methode, stellen Sie das Einspritzvolumen, die Durchflussmenge und den mobilen Phasenzeitgradienten der 1D-Pumpe ein.</li>
	<li>Geben Sie die Beispiellaufzeit unter Stoppzeit ein. Klicken Sie auf das Hauptmenü Instrument und klicken Sie im Dropdown-Menü auf 2D-LC-Methode. Wählen Sie im 2D-LC-Modus die Option Umfassend. Geben Sie 2 Minuten bei der Modulationszeit ein, 1,9 Minuten bei der Stoppzeit für den 2D-Gradienten. Stellen Sie die Flusseinstellungen auf 2 ml ein. Bearbeiten Sie den 2D-Gradienten und stellen Sie ihn auf Wellenlängen ein. Nachdem Sie die Methode bearbeitet haben, wählen Sie im Menü Methode die Option Methode speichern unter aus, um der neuen Methode einen Namen zu geben, und klicken Sie dann auf OK. HINWEIS: Die externe Transferpumpe erfordert eine manuelle Einstellung der Durchflussmenge.</li>
</ol>3. MS-Bedienung
<ol><li>Schalten Sie den Schalter der Vakuumpumpe ein. Öffnen Sie das Hauptventil des Argonzylinders und das Druckteilerventil und stellen Sie den Druck auf ca. 0,3 MPa ein. Öffnen Sie das Stickstoffventil.</li>
	<li>Warten Sie mindestens 8 Stunden, um ein ausreichendes Vakuum für die Versuchsbedingungen zu gewährleisten. Vor der Analyse prüfen, ob der Luftdruck von Argon und Stickstoff hoch genug ist.</li>
	<li>Um die MS-Steuerungssoftware zu starten, klicken Sie im Software-Panel auf die Heiz-SEI-Quelle und geben Sie die MS-Parameter ein, einschließlich der Heiztemperatur (350 °C), der Manteldurchflussrate (35 arb), des Zusatzluftdurchflusses (15 arb), der Sprühspannung (3,8 kV im positiven Modus, -2,5 kV im negativen Modus) und der Kapillartemperatur (275 °C). Klicken Sie auf die Schaltfläche Anwenden , um die Ionenquelle zu aktivieren.</li>
	<li>Um die MS-Methode einzurichten, geben Sie Werte ein, um die Erfassungszeit, die Polarität, den Massenbereich, die Anzahl der Übertragungswerte, die Dauer des Übertragungswerts und vieles mehr zu konfigurieren. MS-Laufzeit einstellen (min): 93.00. ScanEvent-Details einrichten: ITMS + c norm o (100.0-1200.0), CV=0.0v. ITMS + c Norm Dep MS/MS, intensivstes Ion aus (1): Aktivierungstyp: CID, Min. Signal erforderlich: 500, Isolationsbreite: 2.00, Normalisierte Coll. Energie: 35.0, Standardladezustand: 3, Aktivierung Q: 0.250, Aktivierungszeit: 93.000. Um datenabhängige Einstellungen vorzunehmen, verwenden Sie separate Polaritätseinstellungen als deaktiviert, Neutralverlust oben: 3, Produkt oben: 3. Klicken Sie auf Speichern , um die Einstellungen als Gerätemethode zu konfigurieren. HINWEIS: Das Ende der Laufzeit stimmt mit dem des 2D-LC überein.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Sequenz einrichten , um die Sequenztabelle zu öffnen. Geben Sie den Probentyp, den Dateinamen, den Pfad, die Proben-ID, die Gerätemethode, den Ort, die Injektionsmenge und andere Informationen in das Formular ein.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern , um die Sequenzliste aufzuzeichnen, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Analyse starten , um die MS-Erfassung einzurichten und zu starten. Klicken Sie auf Run Control (Steuerung ausführen ) auf dem 2D-LC-Instrument (Run Control) und wählen Sie Run Method (Laufmethode). Gleichzeitig klickt das MS-Instrument auch auf die Schaltfläche Run . HINWEIS: Da 2D-LC und MS in diesem Experiment nicht von derselben Software gesteuert werden, müssen sie auf beiden Instrumenten separat eingerichtet werden.</li>
</ol>4. Funktionsweise des molekularen Netzwerks
<ol><li>Datenaufbereitung: Exportieren Sie 2D-HPLC-MS-Massenspektraldaten und konvertieren Sie sekundäre Massenspektraldaten in mzXML- oder mzML-Daten über Msconvert von ProteoWizard. (http://proteowizard.sourceforge.net/).</li>
	<li>Um Daten hochzuladen, laden Sie die WinSCP-Software von der offiziellen Website herunter und laden Sie mzML-Daten über das FTP-Protokoll auf das von GNPS erstellte Konto hoch. Sobald die Installation abgeschlossen ist, starten Sie WinSCP.</li>
	<li>Verbindung zum GNPS-FTP-Server herstellen: Geben Sie in der WinSCP-Benutzeroberfläche auf der Sitzungskonfigurationsseite die folgenden Verbindungsinformationen ein: Dateiprotokoll: Wählen Sie FTP aus. Für Hostname: Geben Sie massive.ucsd.edu. ein, für Portnummer: Behalten Sie den Standardwert 22 bei.</li>
	<li>Geben Sie die Kontonummer und das Passwort ein. Nachdem Sie die obigen Informationen eingegeben haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Anmelden , um eine Verbindung zum GNPS-FTP-Server herzustellen.</li>
	<li>Erstellen Sie molekulare Netzwerke, indem Sie einen Webbrowser öffnen und die GNPS-Website (https://gnps.ucsd.edu/) besuchen. Neue Benutzer müssen sich für ein Konto anmelden und sich dann anmelden.</li>
	<li>Klicken Sie auf der Hauptoberfläche der GNPS-Website in der oberen Navigationsleiste auf die Registerkarte Aufgaben und wählen Sie im Dropdown-Menü die Option Neue Aufgabe erstellen aus. Klicken Sie auf der Seite zur Aufgabenerstellung auf die Schaltfläche Dateien hinzufügen , wählen Sie die Datendatei aus und laden Sie sie hoch. (z. B. mzML-Format).</li>
	<li>Legen Sie auf der Registerkarte Task-Parameter die verschiedenen Parameter fest, mit denen der MN generiert wird. Zu diesen Parametern gehören der Peak-Extraktionsalgorithmus, der Peak-Überlaufwert, die Ähnlichkeitsberechnungsmethode usw. Nehmen Sie bei Bedarf die entsprechenden Parametereinstellungen vor. Klicken Sie unten auf der Seite auf die Schaltfläche Analyse starten , um die Aufgabe auszuführen.</li>
	<li>Suchen Sie nach dem Ausführen der Aufgabe die erstellte Aufgabe in der Aufgabenliste, und klicken Sie auf den Dienstnamen , um die Analyseergebnisse anzuzeigen. Die Website bietet MN-Diagramme, Substitute, symbiotische Netzwerke und andere verwandte Informationen.</li>
</ol>

Analyse der tibetischen Heilpflanze APB mittels 2D-HPLC-MS mit molekularer Vernetzung

<ol>
	<li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+Tibetan+and+traditional+Chinese+medicine+body+constitutions:+A+cross-sectional+study+of+Tibetan+college+students+in+the+Tibet+Autonomous+Region.">Correlation between Tibetan and traditional Chinese medicine body constitutions: A cross-sectional study of Tibetan college students in the Tibet Autonomous Region.</a> J Tradl Chinese Med Sci. 5 (3), 215-221 (2018).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+identification+of+compound+structure+in+Tibetan+medicine+using+ion+trap+mass+spectrometry+and+multiple-stage+fragmentation+analysis.">Standardized identification of compound structure in Tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis.</a> J Vis Exp. (193), 65054 (2023).</li><li>Kumar, P. R., Dinesh, S. R., Rini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LCMS-a+review+and+a+recent+update.">LCMS-a review and a recent update.</a> J Pharm Pharm Sci. 5, 377-391 (2016).</li><li>Yan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+the+identification+and+quantitative+analysis+of+the+phytochemicals+of+traditional+Chinese+medicine+by+LC-MS/MS.">Strategy for the identification and quantitative analysis of the phytochemicals of traditional Chinese medicine by LC-MS/MS.</a> Acta Pharm Sinica. 55 (7), 1494-1503 (2020).</li><li>Iguiniz, M., Heinisch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+liquid+chromatography+in+pharmaceutical+analysis.+Instrumental+aspects,+trends+and+applications.">Two-dimensional liquid chromatography in pharmaceutical analysis. Instrumental aspects, trends and applications.</a> J Pharma Biomed Anal. 145, 482-503 (2017).</li><li>Ye, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+progress+of+2D-LC+in+analysis+and+quality+control+of+traditional+Chinese+medicine.">Application progress of 2D-LC in analysis and quality control of traditional Chinese medicine.</a> Chem Reag. 44 (8), 1103-1110 (2022).</li><li>Cao, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+comprehensive+two-dimensional+hydrophilic+interaction+chromatography+x+reversed-phase+liquid+chromatography+coupled+with+hybrid+linear+ion+trap+Orbitrap+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+phenolic+acids+in+Salvia+miltiorrhiza.">Online comprehensive two-dimensional hydrophilic interaction chromatography x reversed-phase liquid chromatography coupled with hybrid linear ion trap Orbitrap mass spectrometry for the analysis of phenolic acids in Salvia miltiorrhiza.</a> J Chromatogr A. 1536, 216-227 (2018).</li><li>Cao, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+characterization+of+phenolic+and+diterpenoid+constituents+in+Danshen+(Salvia+miltiorrhiza)+by+comprehensive+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+with+hybrid+linear+ion+trap+Orbitrap+mass.">Qualitative and quantitative characterization of phenolic and diterpenoid constituents in Danshen (Salvia miltiorrhiza) by comprehensive two-dimensional liquid chromatography coupled with hybrid linear ion trap Orbitrap mass.</a> J Chromatogr. 1427, 79-89 (2016).</li><li>Wang, J., Ren, X., Wen, C., Xu, Y., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+characterization+of+unknown+impurities+in+rutin+tablets+using+trap-free+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+with+ion+trap/time-of-flight+mass+spectrometry.">Separation and characterization of unknown impurities in rutin tablets using trap-free two-dimensional liquid chromatography coupled with ion trap/time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 34 (10), e8739 (2020).</li><li>Ma, L. J., Ma, N., Cao, J. L., Wan, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+influence+of+different+drying+methods+on+chemical+components+of+Panax+notoginseng+leaves+by+heart-cutting+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+to+orbitrap+high-resolution+mass+spectrometry.">Characterizing the influence of different drying methods on chemical components of Panax notoginseng leaves by heart-cutting two-dimensional liquid chromatography coupled to orbitrap high-resolution mass spectrometry.</a> Food Chem. 369, 130965 (2022).</li><li>Wong, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+profiling+of+Glycyrrhiza+glabra+extract+with+comprehensive+two-dimensional+liquid+chromatography-mass+spectrometry+using+multi-segmented+shift+gradients+in+the+second+dimension:+Expanding+the+metabolic+coverage.">Untargeted profiling of Glycyrrhiza glabra extract with comprehensive two-dimensional liquid chromatography-mass spectrometry using multi-segmented shift gradients in the second dimension: Expanding the metabolic coverage.</a> Electrophoresis. 39 (15), 1993-2000 (2018).</li><li>Cao, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensively+qualitative+and+quantitative+analysis+of+ginsenosides+in+Panax+notoginseng+leaves+by+online+two-dimensional+liquid+chromatography+coupled+to+hybrid+linear+ion+trap+Orbitrap+mass+spectrometry+with+deeply+optimized+dilution+and+modulation+system.">Comprehensively qualitative and quantitative analysis of ginsenosides in Panax notoginseng leaves by online two-dimensional liquid chromatography coupled to hybrid linear ion trap Orbitrap mass spectrometry with deeply optimized dilution and modulation system.</a> Anal Chim Acta. 1079, 237-251 (2019).</li><li>Nothias, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature-based+molecular+networking+in+the+GNPS+analysis+environment.">Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment.</a> Nat methods. 17 (9), 905-908 (2020).</li><li>Qin, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS/MS-based+molecular+networking:+an+efficient+approach+for+natural+products+Dereplication.">MS/MS-based molecular networking: an efficient approach for natural products Dereplication.</a> Molecules. 28 (1), 157 (2023).</li><li>Qu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multidimensional+chromatography-mass+spectrometry+and+feature-based+molecular+networking+methods+for+the+systematic+characterization+of+compounds+in+the+supercritical+fluid+extract+of+Tripterygium+wilfordii+Hook+F.">Combining multidimensional chromatography-mass spectrometry and feature-based molecular networking methods for the systematic characterization of compounds in the supercritical fluid extract of Tripterygium wilfordii Hook F.</a> Analyst. 148 (1), 61-73 (2023).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+analytical+strategy+integrating+offline+two-dimensional+liquid+chromatography+with+high-resolution+accurate+mass+spectrometry+and+molecular+networking:+Comprehensive+characterization+of+HuangLian+JieDu+Decoction+as+a+case+study.">An enhanced analytical strategy integrating offline two-dimensional liquid chromatography with high-resolution accurate mass spectrometry and molecular networking: Comprehensive characterization of HuangLian JieDu Decoction as a case study.</a> J Sep Sci. 45 (14), 2734-2745 (2022).</li><li>Dai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+Sanguisorba+officinalis+using+offline+two-dimensional+mixed-mode+liquid+chromatography+&#215;+reversed-phase+liquid+chromatography,+tandem+high-resolution+mass+spectrometry,+and+molecular+network.">Comprehensive profiling of Sanguisorba officinalis using offline two-dimensional mixed-mode liquid chromatography &#215; reversed-phase liquid chromatography, tandem high-resolution mass spectrometry, and molecular network.</a> J Sep Sci. 45 (10), 1727-1736 (2022).</li><li>Chen, Y., Montero, L., Luo, J., Li, J., Schmitz, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+new+at-column+dilution+(ACD)+modulator+for+the+two-dimensional+RP&#215;+HILIC+analysis+of+Buddleja+davidii.">Application of the new at-column dilution (ACD) modulator for the two-dimensional RP&#215; HILIC analysis of Buddleja davidii.</a> Anal Bioanal Chem. 412 (7), 1483-1495 (2020).</li><li>Zhou, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+action+and+toxicity+of+Aconite+and+its+main+components.">Pharmacological action and toxicity of Aconite and its main components.</a> Acta Pharm Sinica. (05), 394-400 (1983).</li><li>Shao, X., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+the+role+of+14-Benzoylaconine+in+rheumatoid+arthritis.">Progress in the role of 14-Benzoylaconine in rheumatoid arthritis.</a> Chinese J Pharmacol Toxicol. 33 (10), 917 (2019).</li><li>Hao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Study on the chemical constituents of the alkaloids from the root of Aconitum flavum HandMazz and its anti-tumor activities. , (2015).</li><li>Han, X., Hou, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+on+the+pharmacological+effects+and+toxicity+of+Aconitine.">Research progress on the pharmacological effects and toxicity of Aconitine.</a> J China Prescrip Drug. 12 (12), 149-150 (2014).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Der Schwerpunkt dieses Versuchs lag auf der Optimierung eines partiellen Verfahrens im Rahmen der zweidimensionalen Flüssigphasentrennung. Um dies zu erreichen, wurde ein neuartiger At-Säulen-Verdünnungsmodulator nahtlos in das zweidimensionale Flüssigkeitschromatographie-System (2D-LC) integriert. Diese technische Anpassung war von größter Bedeutung, da sie die Fähigkeit zur Profilierung der chemischen Bestandteile der tibetischen Medizin, bekannt als APB, erheblich verbesserte. Die Integration der 2D-HPLC-MS-Tec...

Die tibetische Medizin ist ein integraler Bestandteil der traditionellen chinesischen Medizin, die sich an die Prinzipien der tibetischen Medizin hält und zur Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten eingesetztwird 1. Die tibetische Kräutermedizin enthält jedoch komplexe pflanzliche chemische Bestandteile, die durch erhebliche Gehaltsschwankungen gekennzeichnet sind. Das begrenzte Verständnis der grundlegenden bioaktiven Elemente ist zu einem Engpass bei der Modernisierung der tibetischen Medizin geworden2. Die Anwendung der Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS), die die starke Trennkraft der Chromatographie mit der hohen Empfindlichkeit der Massenspektrometrie (MS) kombiniert, ist in der naturmedizinischen Analytik weit verbreitet3. Aufgrund der Beschränkung auf einen einzigen Trennmechanismus neigen Komponenten mit sehr ähnlichen Strukturen jedoch dazu, bei der eindimensionalen Flüssigkeitschromatographie-Trennung zu koelutieren. In der anschließenden massenspektrometrischen Analyse sind die koeluierten Komponenten mit geringer Abundanz aufgrund der Ionensuppression, die durch Komponenten mit hoher Abundanz verursacht wird, schwer zu detektieren4.
Die 2D-HPLC, die Abkürzung für zweidimensionale Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, stellt ein neuartiges chromatographisches Verfahren dar, das verschiedene Trennmechanismen mittels eines Säulenpaares harmonisch miteinander verbindet. Dies umfasst die Fusion oder Abwechslung der Normalphasenchromatographie mit der Umkehrphasenflüssigkeitschromatographie und der hydrophilen Wechselwirkungsflüssigkeitschromatographie mit der Umkehrphasenflüssigkeitschromatographie5. Durch die Zusammenführung dieser komplementären chromatographischen Eigenschaften wird die verbesserte Trennfähigkeit erreicht, wodurch die Herausforderungen, die durch komplexe Probenmatrizen verursacht werden, effektiv bewältigtwerden 6. Darüber hinaus können durch die Kopplung der zweidimensionalen Chromatographie mit MS die leistungsstarke Trennfähigkeit der 2D-HPLC und die hochempfindliche Detektionsfähigkeit der MS vollständig integriert werden, was die Untersuchung komplexer Wirkstoffsysteme und ihrer grundlegenden Bestandteile unterstützt 7,8,9.
Die tibetische Medizin zeichnet sich im Allgemeinen durch eine facettenreiche Palette von Komponenten und Funktionalitäten aus, wobei die Wirkstoffe in der Regel in komplizierten Zusammensetzungen und in minimalen Konzentrationen vorliegen. Durch die Integration von 2D-LC als robustem Trennsystem und MS als äußerst empfindlichem Detektor können die Herausforderungen, die komplizierte Proben in Bezug auf Trennung und Identifizierung mit sich bringen, effektiver bewältigt werden 10,11,12. Diese Verschmelzung trägt wesentlich dazu bei, die Erforschung der chemischen Zusammensetzung der tibetischen Medizin voranzutreiben.
Unabhängig davon, ob es sich um eine traditionelle LC-MS oder 2D-LC-MS handelt, kann eine große Menge an Informationen gewonnen werden. Die Extraktion von Strukturinformationen komplexer Systemkomponenten aus dieser riesigen Informationsmenge war jedoch schon immer eine große Herausforderung. Daher haben die Forscher verschiedene Methoden entwickelt, um MS-Daten zu screenen und zu verwerten. Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) ist eine MS/MS-Datenorganisations- und Visualisierungsplattform, auf der 2D-LC-MS-Massenspektrometriedaten hochgeladen werden können13. Jedes Spektrum wird als Vektor betrachtet und mit allen anderen Spektren unter Verwendung der Kosinusähnlichkeit verglichen. Wenn die Ähnlichkeit zwischen zwei Spektren einen Schwellenwert überschreitet, werden sie in einem molekularen Netzwerk (MN) verbunden. Dies kann für die schnelle Identifizierung bekannter Verbindungen und die Bestimmung verschiedener unbekannter Naturstoffe verwendet werden14.
Die tibetische Medizin hat in der Regel mehrere Funktionen, aber ihre komplexe Zusammensetzung und ihre signifikanten Konzentrationsunterschiede machen es schwierig, den Zusammenhang zwischen Funktion und materieller Basis effektiv aufzuklären15. Eine vertiefte Beschäftigung mit der tibetischen Medizin erfordert die systematische Charakterisierung möglichst vieler Komponenten. Im Rahmen dieser Studie beabsichtigen wir, APB in der tibetischen Medizin als Forschungsobjekt zu verwenden, um die Strategie und den Prozess der systematischen Untersuchung der komplexen chemischen Komponenten der tibetischen Medizin mit Hilfe der 2D-HPLC-MS-Technologie und der MN-Technologie zu demonstrieren. Bei der Konstruktion des 2D-chromatographischen Systems haben wir die Umkehrphasen-Flüssigchromatographie und die hydrophile Wechselwirkungsflüssigkeitschromatographie mit signifikanten Trennmechanismen kombiniert, um eine effektivere Trennung der komplexen Komponenten von APB16 zu erreichen. Um die Lösungsmittelinkompatibilität zwischen den beiden Dimensionen zu überwinden, wurde außerdem ein Verdünnungsmodulationsmodus an der Säule eingeführt. Durch die Kombination der leistungsstarken Trennfähigkeit von 2D-LC mit der hochempfindlichen Detektionsfähigkeit von MS werden die spektralen Informationen der komplexen Komponenten in APB effektiver und umfassender erhalten. Darüber hinaus werden durch die Vernetzung und Visualisierung massiver spektraler Informationen durch die MN-Technologie die Komponenten von APB systematisch analysiert. Es wird erwartet, dass die in dieser Studie gezeigte Strategie und der Prozess auf die Erforschung anderer tibetischer Arzneimittel angewendet werden und die Forschung über die materiellen Grundlagen der tibetischen Medizin fördern, was für die Förderung der Ressourcen der tibetischen Medizin und die Verbesserung der Qualitätskontrollstandards für tibetische Kräuter von großer Bedeutung ist17. Der gesamte Versuchsprozess ist in Abbildung 1 dargestellt.
In dem hier vorgestellten Experiment wurde ein neuer At-Säulen-Verdünnungsmodulator in das zweidimensionale Flüssigkeitschromatographie-System (2D-LC) von Agilent18 eingeführt. Durch das Hinzufügen einer unabhängigen Förderpumpe wurde der Strömungsweg der Analyse verändert, was zu einer hohen Orthogonalität der 2D-LC-Analyse führte. Das Ankuppeln und Umschalten zwischen den beiden Dimensionen erfolgt durch zwei Sechswegeventile, wie in Abbildung 2 dargestellt. Wenn eine Probenschleife in der ersten Dimension gefüllt ist, wird eine andere Probenschleife in der zweiten Dimension analysiert. Das bedeutet, dass die Füllzeit der 1D-Schleife und die Laufzeit der 2D gleich sind. Dies erfordert den schnellen Gradienten, der von der binären Pumpe in der zweiten Dimension erzeugt wird. Bei der Analyse des gesamten Abwassers gehen keine Spitzen verloren. Dies ist besonders hilfreich für die Analyse unbekannter Proben. Das Ergebnis ist eine große Anzahl von 2D-Chromatogrammen, die für die Datenanalyse kombiniert werden müssen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>F22M81203</td>
			<td>Mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aconitum pendulum</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Herb medicine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity (II) 2D-LC&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2198-90001</td>
			<td>Liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringes</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>1ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>3ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid phase injection bottle</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>1.5ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ XL Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LTQ21991</td>
			<td>Mass Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microporous membranes&#160;</td>
			<td>Chengdu Keen experimental equipment</td>
			<td>/</td>
			<td>0.22&#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate XB-C18,5 &#956;m,2.1 x 200 mm</td>
			<td>Welch</td>
			<td>00201-31015</td>
			<td>Reversed-phase column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>GT Sonic</td>
			<td>UGT20DEC048Y</td>
			<td>Ultrasonic Cleaner 240W 40KHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAmide,3 &#956;m,100A</td>
			<td>Dalian Mondi Technology</td>
			<td>D2019110601</td>
			<td>Hydrophilic column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d-hplc-ms technology combined with molecular network for the identification of components in tibetan medicine aconitum pendulum

In dieser Studie wurde ein umfassender Ansatz verfolgt, bei dem die 2D-HPLC-MS-Technologie in Verbindung mit dem molekularen Netzwerk verwendet wurde, um die komplizierte chemische Zusammensetzung der tibetischen Heilpflanze APB zu entschlüsseln. Durch die Implementierung der 2D-HPLC wurde eine verbesserte Trennung komplexer Gemische erreicht, die die Isolierung einzelner Verbindungen für die anschließende Analyse ermöglicht. Der Ansatz des molekularen Netzwerks trug weiter zur Aufklärung der strukturellen Beziehungen zwischen diesen Verbindungen bei und trug zur Bestimmung potenzieller bioaktiver Moleküle bei. Diese integrierte Strategie identifizierte effizient eine breite Palette chemischer Komponenten, die in der Anlage vorhanden sind. Die Ergebnisse zeigten ein vielfältiges Spektrum chemischer Bestandteile innerhalb von APB, darunter Alkaloide. Diese Forschung fördert nicht nur das Verständnis des phytochemischen Profils dieser traditionellen tibetischen Medizin, sondern liefert auch wertvolle Einblicke in ihre potenziellen therapeutischen Eigenschaften. Die Integration von 2D-HPLC-MS und molekularem Netzwerk erweist sich als leistungsfähiges Werkzeug zur systematischen Erforschung und Identifizierung komplexer chemischer Zusammensetzungen in pflanzlichen Arzneimitteln und ebnet den Weg für weitere Forschung und Entwicklung im Bereich der Naturstoffentdeckung.

Tibetan medicine is an integral part of traditional Chinese medicine, adhering to the principles of Tibetan medical practices, and is used for disease prevention and treatment1. However, Tibetan herbal medicine contains complex plant chemical constituents characterized by significant fluctuations in content. Limited understanding of the fundamental bioactive elements has become a bottleneck in the modernization of Tibetan medicine2. The application of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), combining the strong separation power of chromatography with the high sensitivity of mass spectrometry (MS), has been widely used in natural medicine analysis3. However, due to the limitation of a single separation mechanism, components with highly similar structures tend to coelute in one-dimensional liquid chromatography separation. In subsequent mass spectrometric analysis, the low-abundance co-eluted components are difficult to detect due to ion suppression caused by high-abundance components4.
2D-HPLC, which stands for two-dimensional high-performance liquid chromatography, represents a novel chromatographic method that harmoniously combines different separation mechanisms using a pair of columns. This includes the fusion or alternation of normal-phase chromatography with reversed-phase liquid chromatography and hydrophilic interaction liquid chromatography with reversed-phase liquid chromatography5. By merging these complementary chromatographic properties, the enhanced separation capability is achieved, effectively addressing the challenges caused by complex sample matrices6. Furthermore, by coupling two-dimensional chromatography with MS, the powerful separation ability of 2D-HPLC and the high sensitivity detection capability of MS can be fully integrated, providing support for the study of complex drug systems and their fundamental constituents7,8,9.
Tibetan medicine commonly features a multifaceted array of components and functionalities, where active ingredients typically exist in intricate compositions and at minimal concentrations. By integrating 2D-LC as a robust separation system and MS as an exceedingly sensitive detector, the challenges posed by intricate samples in terms of separation and identification can be more effectively addressed10,11,12. This amalgamation substantially contributes to advancing the exploration of the chemical composition of Tibetan medicine.
Regardless of whether it is traditional LC-MS or 2D-LC-MS, a vast amount of information can be obtained. However, extracting structural information of complex system components from this massive amount of information has always been a significant challenge. Therefore, researchers have developed various methods for screening and mining MS data. Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) is an MS/MS data organization and visualization platform where 2D-LC-MS mass spectrometry data can be uploaded13. Each spectrum is considered as a vector and compared to all other spectra using cosine similarity. When the similarity between two spectra exceeds a threshold, they are connected in a molecular network (MN). This can be used for the rapid identification of known compounds and the determination of various unknown natural products14.
Tibetan medicine usually has multiple functions, but its complex composition and significant concentration differences make it difficult to effectively elucidate the relationship between function and material basis15. An in-depth study of Tibetan medicine requires the systematic characterization of as many components as possible. In the framework of this study, we intend to use APB in Tibetan medicine as the research object to demonstrate the strategy and process of systematically studying the complex chemical components of Tibetan medicine using 2D-HPLC-MS technology and MN technology. In the construction of the 2D chromatographic system, we combined reversed-phase liquid chromatography and hydrophilic interaction liquid chromatography with significant separation mechanisms to achieve more effective separation of the complex components of APB16. In addition, to overcome solvent incompatibility between the two dimensions, an at-column dilution modulation mode was adopted. By combining the powerful separation capability of 2D-LC with the high sensitivity detection capability of MS, the spectral information of the complex components in APB is obtained more effectively and comprehensively. Furthermore, through the network and visualization of massive spectral information by MN technology, the components of APB are systematically analyzed. The strategy and process demonstrated in this study are expected to be applied to the study of other Tibetan medicines, promoting research on the material basis of Tibetan medicine, which is of great significance for advancing Tibetan medicine resources and improving quality control standards for Tibetan herbs17. The overall experimental process is shown in Figure 1.
In the experiment presented here, a new at-column dilution modulator was introduced into the Agilent two-dimensional liquid chromatography (2D-LC) system18. By adding an independent delivery pump, the flow path of the analysis was changed, resulting in a high orthogonality of the 2D-LC analysis. The coupling and switching between the two dimensions are accomplished by two six-port valves, as shown in Figure 2. When one sample loop is filled in the first dimension, another sample loop is analyzed in the second dimension. This means that the filling time of the 1D loop and the running time of the 2D are equal. This requires the fast gradient generated by the Binary pump in the second dimension. No peaks are lost when the entire effluent is analyzed. This is particularly helpful for the analysis of unknown samples. It results in a large number of 2D chromatograms that need to be combined for data analysis.

Autor im Rampenlicht: Integration von 2D-HPLC-MS und molekularer Vernetzung in der naturmedizinischen Analytik

2D-HPLC-MS-Technologie kombiniert mit molekularem Netzwerk zur Identifizierung von Bestandteilen in der tibetischen Medizin Aconitum-Pendel

In this study, we employed a comprehensive approach utilizing 2D-HPLC-MS technology in conjunction with molecular networking to unravel the intricate chemical composition of the Tibetan medicinal plant APB. We want to establish a more efficient method for identifying the chemical composition of natural medicines. The main challenging of the current experiments is that the mass spectrometry section is not equipped with high-resolution mass spectrometry, resulting in the detection of different components.2D-LC-MS enables more accurate identification and the quantification of the compounds. Complex mixtures based on sample separation, combined with molecular network technology, it can be better process complex data information and it improves the efficiency and the accuracy of any size. Our laboratory will focus applying existing technologies to get the separation of natural, medicinal, chemical components.

APB wurde als Modellorganismus verwendet, um die Machbarkeit der 2D-HPLC-MS-Technologie in Verbindung mit der MN-Methode zu validieren. Durch den Import der MS-Rohdaten in die MN mit den standardmäßig eingestellten Parametern wurde eine MN generiert. MN ist eine visuelle Rechenstrategie, die alle molekularen Ionen, die in einem vollständigen LC-MS-MS-Experiment nachgewiesen wurden, und die chemischen Beziehungen zwischen diesen molekularen Ionen visualisiert13.
MN ba...

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Diese Studie nutzt die zweidimensionale Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (2D-HPLC-MS) Technologie in Verbindung mit molekularen Netzwerken, um die komplizierte chemische Zusammensetzung der tibetischen Heilpflanze Aconitum pendulum Busch (APB) zu entschlüsseln. Der Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die systematische Erforschung und Identifizierung komplexer chemischer Bestandteile pflanzlicher Arzneimittel.

In this study, a comprehensive approach was employed, utilizing 2D-HPLC-MS technology in conjunction with the molecular network to unravel the intricate ...

In dieser Studie haben wir einen umfassenden Ansatz unter Verwendung der 2D-HPLC-MS-Technologie in Verbindung mit molekularen Netzwerken verwendet, um die komplexe chemische Zusammensetzung der tibetischen Heilpflanze APB zu entschlüsseln. Wir wollen eine effizientere Methode zur Bestimmung der chemischen Zusammensetzung von Naturheilmitteln etablieren. Die größte Herausforderung der aktuellen Experimente besteht darin, dass die Massenspektrometrie-Sektion nicht mit hochauflösender Massenspektrometrie ausgestattet ist, was dazu führt, dass verschiedene Komponenten detektiert werden können.2D-LC-MS ermöglicht eine genauere Identifizierung und Quantifizierung der Verbindungen. Komplexe Gemische auf der Grundlage der Probentrennung, kombiniert mit molekularer Netzwerktechnologie, können komplexe Dateninformationen besser verarbeitet werden und verbessern die Effizienz und Genauigkeit jeder Größe. Unser Labor wird sich auf die Anwendung bestehender Technologien konzentrieren, um die Trennung von natürlichen, medizinischen und chemischen Bestandteilen zu erreichen.

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2D-HPLC-MS Technology Combined with Molecular Network for the Identification of Components in Tibetan Medicine Aconitum pendulum

292 Aufrufe.  Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. In dieser Studie haben wir einen umfassenden Ansatz unter Verwendung der 2D-HPLC-MS-Technologie in Verbindung mit molekularen Netzwerken verwendet, um die komplexe chemische Zusammensetzung der tibetischen Heilpflanze APB zu entschlüsseln. Wir wollen eine effizientere Methode zur Bestimmung der chemischen Zusammensetzung von Naturheilmitteln etablieren. Die größte Herausforderung der aktuellen Experimente besteht darin, dass die Massenspektrometrie-Sektion nicht mit hochauflösender Massen...

Serie: Autor im Rampenlicht: Integration von 2D-HPLC-MS und molekularer Vernetzung in der naturmedizinischen Analytik

In this study, a comprehensive approach was employed, utilizing 2D-HPLC-MS technology in conjunction with the molecular network to unravel the intricate chemical composition of the Tibetan medicinal plant APB. Through the implementation of 2D-HPLC, enhanced separation of complex mixtures was achieved, enabling the isolation of individual compounds for subsequent analysis. The molecular network approach further aided in elucidating structural relationships among these compounds, contributing to the determination of potential bioactive molecules. This integrated strategy efficiently identified a wide array of chemical components present within the plant. The findings revealed a diverse spectrum of chemical constituents within APB, including alkaloids, among others. This research not only advances understanding of the phytochemical profile of this traditional Tibetan medicine but also provides valuable insights into its potential therapeutic properties. The integration of 2D-HPLC-MS and molecular network proves to be a powerful tool for systematically exploring and identifying complex chemical compositions in herbal medicines, paving the way for further research and development in the field of natural product discovery.

This study utilizes two-dimensional high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (2D-HPLC-MS) technology in conjunction with molecular networking to unravel the intricate chemical composition of the Tibetan medicinal plant Aconitum pendulum Busch (APB). The article provides a detailed protocol for the systematic exploration and identification of complex chemical components of herbal medicines.

Forschung

Medizin

Sample Preparation for 2D-HPLC-MS of Aconitum pendulum

Begin sample preparation by weighing the aconitum pendulum bush, or APB. Using a one by 10, 000 sensitivity balance, weigh 0.25 grams of dry APB in a three milliliter micro centrifuge tube. Add 2.5 milliliters of methanol to it and then sonicate for 30 minutes at a power of 240 watts and a frequency of 40 kilohertz.Centrifuge the sonicated sample at 1.2G for five minutes, and collect the supernatant. Filter it through a 0.22 micron membrane filter. Next, prepare the two-dimensional mobile phase by using acetyl nitrile as the organic phase or phase B, and ultra pure water containing 0.1%formic acid as the aqueous phase or phase A.After performing two-phase filtration through the 0.22 micron filter, subject the mobile phases to ultrasonic sonication at 40 kilohertz for 15 minutes.Purge the replaced mobile phase to remove the bubbles. Select a C18 column as the 1D column and a hydrophilic column as the 2D column, and mount them to the instrument. To adjust the appropriate shunt ratio, connect the 2D-LC instrument outline through a T to the mass inlet and the other end of the T to a shunted line.Adjust the flow rate to a suitable value to ensure the appropriate flow rate for the mass spectrum.

Probenvorbereitung für die 2D-HPLC-MS des Aconitum-Pendels

Implementing 2D-Liquid Chromatography on Aconitum pendulum Samples for Enhanced Compound Separation

To begin the 2D liquid chromatography, or 2DLC, double-click the instrument one online icon, and the chemical workstation will automatically communicate with the 1260LC and enter the workstation. For the 2DLC method parameter setting, click on the Injector module, right-click Method and set the injection volume, flow rate, and mobile phase time gradient of the 1D pump. Enter the sample runtime under Stop Time.Click on the main menu instrument and click 2DLC Method on the dropdown menu. Select Comprehensive in 2DLC mode. Enter two minutes at modulation time and 1.9 minutes at 2D gradient stop time.Set flow settings to two milliliters. Edit 2D gradient and set wavelengths. After editing the method, select Save Method As on the method menu to name the new method, and click OK.

Implementierung der 2D-Flüssigkeitschromatographie an Aconitum-Pendelproben zur verbesserten Trennung von Verbindungen

Mass Spectrometry Following the 2D-LC Operation on Aconitum pendulum Samples

To begin, turn on the switch of the vacuum pump. Open the argon cylinder main valve and the pressure divider valve, and adjust the pressure to about 0.3 megapascals. To set up the MS method, enter the runtime in minutes to 93.00 and enter values to configure acquisition time, polarity, mass range, transfer value number, transfer value duration, and more.Set up scan event details according to the values displayed on the screen. To set data dependent settings, use separate polarity settings as disabled. Set neutral loss within top to three, and product mass list within top to three.Save to configure the settings as the instrument method. Click the sequence setup button to open the sequence table. Enter the sample type, file name, path, sample id, instrument method, location, injection amount, and other information in the form.Save the information to record the sequence listing. Then click the start analysis button to set up and start MS acquisition.

Massenspektrometrie nach der 2D-LC-Operation an Aconitum-Pendelproben

Integration of Molecular Network Operation to 2D-HPLC-MS for the Analysis of Aconitum pendulum Samples

To begin the data preparation, export 2D HPLC-MS raw mass spectral data. Next to connect to the GNPS FTP server in the WINSCP interface on the Session Configuration page, fill in the connection information. After filling in the information, click the Start button to establish a connection to the GNPS FTP server.Create molecular networks by opening a web browser and visiting the GNPS website. New users need to sign up for an account and then log in. On the main interface of the GNPS website, click Create Molecular Network under Data Analysis.On the Task Creation page, click the select Input Files button, then select and upload the data file. In the Workflow Option tabs, set the various parameters that generate the molecular network or MN.These parameters include the peak extraction algorithm, peak over travel value, similarity calculation method, and so on. After making the appropriate parameter settings as needed, click the Submit button at the bottom of the page to run the task.After the task runs, find the created tasks in the Jobs tab and click the workflow name to view the analysis results. The website provides MN diagrams, substitutes, symbiotic networks, and other related information. Four of the alkaloid components in the APB samples identified by the MN were aconitine, 14-benzoylaconine, 14-O-acetylneoline and hypaconitine.The four compounds had the same parent nucleus. Aconitine, 14-benzyl aconine, 14-benzoylaconine, and hypaconitine were similar, and only the substituents were different.