Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Zellen in einer halbfesten Matrix zu aggregieren und einzuhüllen. Eingebettete Zellaggregate können dann nachgeschaltet in dreidimensionaler In-vitro-Kultur oder als Vehikel für In-vivo-Transplantationsexperimente verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie eine einfache Methodik und Ausrüstung verwendet, um eine Zellaggregation zu erreichen.
Es kann auch auf eine Reihe von Zelltypen und -nummern angewendet werden. Diese Technik hat einen bestimmten Zelltyp aufgedeckt, der für die Regeneration der Milz erforderlich ist. Es könnte weitere Regulatoren der Milzgeweberegeneration aufdecken oder als Plattform für umfassendere Tissue-Engineering-Studien dienen.
Beginnen Sie mit dem Vorkühlen einer 200-Mikroliter-Pipettenspitzenbox in einem Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius. Tauchen Sie dann Parafilm 10 Minuten lang in 80% Ethanol, gefolgt von einer 10-minütigen Wäsche in PBS. Um die Zelllösung herzustellen, aliquotieren Sie die gewünschte Zellzahl in ein konisches 14-Milliliter-Röhrchen.
Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 g und 4 Grad Celsius für 5 Minuten. Anschließend wird der Überstand vorsichtig abgesaugt und dabei etwa 20 Mikroliter Volumen zurückgelassen. Das Zellpellet kann dann im verbleibenden Überstandsvolumen resuspendiert werden.
Mit einer vorgekühlten Pipettenspitze 2 Mikroliter eiskaltes Matrigel absaugen. Drehen und werfen Sie vorsichtig aus, um die Pipettenspitze zu entfernen. Dehnen Sie einen vorsterilisierten Streifen Parafilm und legen Sie ihn über das Ende der Pipettenspitze, wobei Sie darauf achten, dass der Film nicht durchstochen wird.
Wickeln Sie den Parafilm weiter um die Seite, um sicherzustellen, dass die Spitze versiegelt ist. Schichten Sie dann die Zelllösung sanft über das Matrigel. Lassen Sie die Pipettenspitze auf Eis und bereiten Sie ein konisches 14-Milliliter-Röhrchen mit einem 1,2-Milliliter-Clusterröhrchen vor.
Die Pipettenspitze kann dann in die geschachtelte Röhrchenkonfiguration eingeführt und 5 Minuten lang bei 400 g und 4 Grad Celsius zentrifugiert werden. Inkubieren Sie das Röhrchen 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Das Rohr kann bis zur weiteren Verwendung auf Eis gelegt werden.
Entfernen Sie vorsichtig den Parafilm von der Pipettenspitze, setzen Sie dann einen dünnen Drahtkolben ein und stoßen Sie den Matrigel-Stopfen in das Gewebekulturmedium aus. Die aggregierten Zellen können bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid kultiviert werden. Rasieren Sie das Fell mit einer elektrischen Schermaschine und tupfen Sie die Haut mit 80% Ethanol ab.
Machen Sie einen zwei Zentimeter langen Schnitt in der Haut senkrecht zur Wirbelsäule und legen Sie die Peritonealwand frei. Ein zweiter kleinerer Schnitt wird dann in der Peritonealwand über der Niere gemacht. Üben Sie Druck aus und äussern Sie die Niere.
Stellen Sie sicher, dass die Niere feucht gehalten wird, indem Sie regelmäßig steriles PBS auftragen. Drücken Sie die Nierenkapsel mit einer ultrafeinen Pinzette zusammen und reißen Sie mit einem zweiten Paar vorsichtig in entgegengesetzte Richtungen. Trennen Sie vorsichtig die Kapselmembran vom Nierenparenchym.
Heben Sie die Nierenkapsel mit einer Pinzette an und schieben Sie die Pipettenspitze langsam durch die Öffnung. Führen Sie vorsichtig einen Drahtkolben in die Pipettenspitze ein und stoßen Sie den Matrigel-Stopfen aus. Befeuchten Sie die Niere mit PBS und reinternalisieren Sie sie in die Peritonealhöhle.
Verschließen Sie die Peritonealwand mit 5-O-Vicryl-Nähten und schließen Sie den Hautschnitt mit einem AutoClip-Applier und zwei 9-Millimeter-Wundclips. Ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist die Aggregation von Zellen innerhalb einer halbfesten Matrix. Eine Mittelschichtpositionierung wird durch optimale Zentrifugationsgeschwindigkeiten erreicht.
Höhere Geschwindigkeiten treiben die Zellen bis zur Spitze der Pipette, während unzureichende Geschwindigkeiten die Zellbewegung durch die Matrix verhindern. Nach dem Erstarren kann das Matrigel-Konstrukt aus der Pipettenspitze ausgeworfen werden. Milzstromakonstrukte, die in vitro kultiviert werden, bilden dreidimensionale kugelförmige Organoidstrukturen.
Organoide weisen eine nicht-hohle Struktur auf, bei der Zellen über den gesamten Durchmesser des Gewebes vorhanden sind. Sie bestehen aus drei großen Zellpopulationen, darunter weiße Blutkörperchen, rote Blutkörperchen und nicht-hämopoetische Stroma- und Endothelzellen. Konstrukte können auch unter die Nierenkapsel für Geweberegenerationsstudien transplantiert werden.
Nach vier Wochen kann eine organisierte Milzgewebestruktur beobachtet werden, einschließlich zentraler Arteriolen, B-Zellfollikel, fibroblastischer retikulärer Zellen, myeloischer Zellen der roten Pulpa, metallophiler Makrophagen in der Marginalzone, Sinusoiden der roten Pulpa und follikulärer dendritischer Zellnetzwerke, T-Zell-Zone, roter Pulpa-Makrophagen und retikulärer Zellen der Marginalzone. Beim Versuch der Zellaggregation und -verkapselung ist es wichtig, daran zu denken, schnell zu arbeiten und alle Materialien auf Eis zu halten. Der wichtigste Schritt bei Transplantationen ist das Ausstoßen des Matrigel-Plugs beim Herausziehen der Pipettenspitze aus der Niere.
Es muss darauf geachtet werden, dass die Kapselmembran nicht perforiert oder das Nierenparenchym gerissen wird. Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Anforderungen für zwei Stromazellpopulationen bei der Milzgeweberegeneration zu untersuchen. In diesem repräsentativen Experiment konnten nur Aggregate, die von plättchenabgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptor-beta-positiven MAdCAM-negativen Zellen erschöpft waren, das Gewebewachstum nicht initiieren, was darauf hindeutet, dass diese spezielle Zellpopulation für die Regeneration der Milz unerlässlich ist.
