Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Immunzellmigrationsfeld zu verstehen, wie das Zytoskelett Scherkräfte sendet und wie Integrinligaden und Chemokine die strömungsinduzierte Migration von Leukozyten beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es sich um eine neue Art von Migrationstest handelt, die für Anfänger leicht durchzuführen ist. Es verwendet nur kommerziell erhältliche Geräte und Reagenzien sowie freie Software.
Obwohl diese Methode Einblicke in Randzonen-B-Zellen geben kann, kann sie auch auf andere Immunzellen angewendet werden, z. B. aktivierte T-Zellen. Am Tag vor dem Experiment tauen Sie ein Aliquot von ICAM-1 auf und verdünnen Sie es in PBS auf eine Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter. Dann fügen Sie 30 Mikroliter ICAM-1 in die gewünschten Kammern eines Durchflussschlittens.
Legen Sie die Rutsche in eine feuchte Kammer, und stellen Sie sie auf vier Grad Celsius, um sie über Nacht zu bebrüten. Am nächsten Tag waschen Sie die Kammer, indem Sie 100 Mikroliter PBS zu einem Brunnen hinzufügen und dann 100 Mikroliter aus dem anderen Brunnen der Kammer zurückziehen. Fügen Sie dann 100 Mikroliter Sperrpuffer in eine Kammer und inkubieren Sie die Rutsche in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur für 90 Minuten.
Als nächstes waschen Sie die Kammer, indem Sie 100 Mikroliter PBS zu einem Brunnen hinzufügen, ihn aus dem anderen Brunnen zurückziehen, und fügen Sie dann 100 Mikroliter Migrationspuffer in die Kammer ein. Die Folie ist nun einsatzbereit. Bewahren Sie es bis zum Experiment in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur auf.
Schließen Sie zunächst eine Flüssigkeitspumpe an und befestigen Sie die Fluideinheit. Schalten Sie dann die Pumpensoftware ein. Als nächstes waschen Sie die Schläuche einmal mit fünf bis 10 Milliliter Migrationspuffer.
Dies wird etwa eine Minute dauern. Fügen Sie dann 11,7 Milliliter Migrationspuffer gleichmäßig zu beiden Reservoirs hinzu, und entfernen Sie die Luftblasen. Klemmen Sie nun die Schläuche etwa 10 Zentimeter vom Verbindungsstück entfernt und legen Sie die Fluideinheit in die beheizte Inkubationskammer auf das Mikroskop.
Stellen Sie in der Software die Folienauswahl auf Mikro-Dia VI 0.4 und die Schlauchoption auf Weiß ein. Stellen Sie außerdem die gewünschte Scherspannung auf etwa vier Dynen pro Quadratzentimeter und die Bildgebungszeit auf 30 Minuten ein. Stellen Sie dann die gewünschte Durchflussmenge und Scherspannung ein, indem Sie die Werte in die Pumpensoftware eingeben.
Anschließend wird die Mikroskop-Inkubationskammer, die Fluidikeinheit und der Migrationspuffer auf 37 Grad Celsius vorwärmen. Einmal warm, testen Sie die Fluidpumpe, um sicherzustellen, dass der Migrationspuffer in den Reservoirs hin und her fließt und keine Luftblasen im System vorhanden sind. Erstens, isolieren Leukozyten, und reinigen Sie die Randzone B-Zellen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.
Reinigen Sie dann den Boden des Schlittens mit einem ethanolgedämpften Gewebe. Fügen Sie 30 Mikroliter der Zellsuspension in einen Brunnen der Kammer und ziehen Sie 30 Mikroliter des gespeicherten Migrationspuffers aus dem anderen Brunnen ab. Bedecken Sie die Folie, und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang, damit die Zellen angefügt werden können.
Als nächstes fügen Sie langsam vorgewärmten Migrationspuffer zu jedem Brunnen der Rutsche hinzu, bis ein positiver Meniskus aus dem Brunnen steigt. Entfernen Sie alle Luftblasen mit der Pipettenspitze. Es ist wichtig, die Konsistenz mit Faktoren zu erhalten, die die Zellhaftung beeinflussen, also halten Sie die Puffer und die Zellen bei 37 Grad, und vermeiden Sie übermäßige Kraft beim Pipettieren des Puffers in die Kammer.
Klemmen Sie den Schlitten auf die Mikroskopstufe, und entfernen Sie die nicht markierte Seite des Fluidrohres aus dem Verbindungsstück. Dann füllen Sie das Ende des Schlauches mit Migrationspuffer, bis ein positiver Meniskus ohne Luftblasen aus dem Ende steigt. Drehen Sie das Ende des Schlauches um, und legen Sie es in den oberen Brunnen der Strömungskammer ein.
Wiederholen Sie den Prozess für das markierte Ende des Schlauches, während Sie die Schläuche geklemmt halten. Wechseln Sie nun das Bildgebungssystem in den Live-Modus, und wählen Sie ein Sichtfeld aus, das sich in der Mitte der Folie befindet. Legen Sie hier den Fokus auf die Zellen und defokussieren Sie dann leicht, um die schwarze Umrisslinie der Zellen zu verbessern und ein weißes Inneres zu erzeugen.
Der schwarze Hintergrund und das weiße Zentrum werden im automatisierten Tracking-Programm einfacher zu verwenden sein. Richten Sie das Bildsequenzprogramm ein, um ein Bild alle fünf Sekunden für 30 Minuten mit einem 10-fach trockenen Objektiv aufzunehmen. Beginnen Sie dann mit der Aufnahme.
Entfernen Sie die Klemme aus dem Schlauch, und schalten Sie die Pumpe ein. Dies führt dazu, dass die nicht haftenden Zellen abwaschen und anhaftende Zellen zu migrieren beginnen. Am Ende des Imaging-Programms den Film beschriften und speichern.
Wenn Sie einen Inhibitor oder einen Modifikator der Zellmigration verwenden, kann er entweder den Zellen in der Zellsuspension hinzugefügt werden, bevor sie auf dem Dia oder dem Migrationspuffer in der Fluidikeinheit angezeigt werden. Um mit der automatischen Migrationsspuranalyse zu beginnen, öffnen Sie das ImageJ-Programm. Kopieren Sie die MTrack2_kt Java-Datei in den Ordner ImageJ Plugins.
Wählen Sie im Menü Plugins Kompilieren und Ausführen aus. Starten Sie dann ImageJ neu, und das Plugin sollte im Plugins-Menü angezeigt werden. Öffnen Sie den Bildstapel aus dem Zellenmigrationsfilm in ImageJ, und verarbeiten Sie die Bilder wie hier gezeigt, um das Video von Farbrahmen in kontrastreiche Bilder zu konvertieren, die die Zellen als schwarze Objekte auf weißem Hintergrund anzeigen.
Als nächstes schärfen Sie die Bilder zweimal, entschärft die Bilder und konvertieren Sie die Bilder dann in acht Bit. Wechseln Sie im Menü Bild zum Untermenü Helligkeit/Kontrast anpassen, und setzen Sie den Schieberegler Kontrast mit maximalem Kontrast. Dadurch werden die Zellen als weiße Objekte auf schwarzem Hintergrund angezeigt.
Kehren Sie dann zum Untermenü Schwellenwert anpassen zurück, um sicherzustellen, dass die Zellen als schwarze Objekte auf weißem Hintergrund angezeigt werden. Führen Sie nun das automatische Zellverfolgungs-Plugin MTrack2 kt aus. Legen Sie auf dem Optionsbildschirm die Partikelgröße auf ein Pixel und die Partikelgröße maximal auf 30 Pixel fest.
Legen Sie den Geschwindigkeitswert auf 10 Pixel fest, obwohl Die Zellen der Randzone B in der Regel zwei Pixel auf aufeinander folgenden Frames, die fünf Sekunden voneinander entfernt sind, nicht überschreiten. Die Zellspuren sind nun mit dem ibidi Chemotaxis Tool zur Analyse bereit. Diese beiden Felder zeigen die Migrationspfade von Randzonen-B-Zellen, die auf ICAM-1-beschichteten Dias gesät wurden.
Die Zellen wurden automatisch mit MTrack2 mit den in diesem Artikel beschriebenen Methoden nachverfolgt. Auf der linken Seite wurden Zellen unter statischen Bedingungen abgebildet, und auf der rechten Seite wurden Zellen einem Scherstrom von vier Dynen pro Quadratzentimeter ausgesetzt. Die einzelnen Zellspuren können in das ibidi Chemotaxis Tool importiert werden, um Track-Plots für jeden Film zu generieren.
Hier sind die einzelnen Zellspuren rot gefärbt, um anzuzeigen, dass sie flussabwärts ihres Ursprungspunkts oder schwarz endeten, wenn sie stromaufwärts endeten. Die Analyse von Zellspuren aus vier Einzelfilmen für beide Strömungs- und keine Strömungsbedingungen wird hier gezeigt. Dazu gehören der durchschnittliche Richtungsmigrationsindex, die Zellengeschwindigkeit, die Pfadgerade und die endgültige geradlinige Entfernung für beide Bedingungen.
Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Richtungsmigration von Randzonen-B-Zellen in Richtung Scherfluss abbilden und wie Sie die Zellen automatisch verfolgen. Während dieses Verfahrens können andere Methoden wie die TIRF-Mikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. wie das Zytoskelett und die Integrine auf Scherstress reagieren?
