Unser Protokoll ermöglicht die detaillierte Identifizierung und Analyse von Monozyten und Makrophagen und T-Zellen und deren relevanten Teilmengen innerhalb der Neuronen und Eizellen und verschiedener anderer Gewebe des Immunsystems. Unsere Technik erleichtert die zuverlässige Entnahme von Lebensimmunzellen aus dem Synovium und anderen relevanten Geweben für eine umfassende Charakterisierung der osteoarthritischen Immunantwort. Für die Isolierung von Geweben von Interesse von einer Arthrose Modell Maus, mit der Maus in einer Supine-Position, wischen Sie die Brust, Bauch und Beine mit 70%Ethanol.
Verwenden Sie eine Schere, um die Haut entlang der Mittellinie des Bauches vorsichtig zu öffnen, während die Bauchhöhle intakt bleibt. Und ziehen Sie die Haut auf der rechten Seite des Tieres sanft vom darunter liegenden Muskel weg, so dass das subkutane Fettgewebe an der Haut befestigt bleibt. Legen Sie die Maus unter ein sezierendes Mikroskop und verwenden Sie zwei gekrümmte feine Zangen, um das Fettgewebe am Oberschenkel sanft herauszukitzeln.
Nach der Identifizierung der drei Kreuzgefäße, verwenden Sie feine Sezieren Zangen, um die Leistenlymphknoten am Schnittpunkt der Gefäße zu entfernen, achten Darauf, nicht die Kapsel zu brechen. Verwenden Sie die Zange, um das restliche Fett von der Oberfläche des Lymphknotens zu entfernen und die Bauchhöhle zu öffnen. Wenn kein restliches Fett zu sehen ist, legen Sie den Lymphknoten sofort in eine zuvor vorbereitete und mit 0,5 Milliliter RPMI-Medien gefüllte welle Platte.
Öffnen Sie danach die Bauchhöhle. Verwenden Sie eine feine Schere, um die Milz zu verbrauchen und den Darm sanft zu extrahieren, um die Aorta und ihre Bifurkation zu belichten. Danach legen Sie die Milz sofort in eine zuvor vorbereitete und beschriftete sechs gut gespielte gefüllte mit 0,5 Milliliter RPMI-Medien gefüllt.
Entfernen Sie den iliac Lymphknoten am Terminalsegment der Bauchaorta und den Ursprung der gemeinsamen Iliasarterie und entfernen Sie vorsichtig die Haut von beiden Hinterbeinen. Legen Sie den Lymphknoten sofort in einen zuvor vorbereiteten und beschrifteten sechs Brunnenplattenbau mit 0,5 Millilitern RPMI-Medien, die alle Lymphknoten von zwei Tieren bündeln. Mit einer feinen Schere oder einem Skalpell reinigen Sie den linken Oberschenkelknochen des angehängten Muskelgewebes und trennen sorgfältig sowohl das Ersticken als auch das Hüftgelenk, so dass der gesamte Knochen intakt bleibt, während der Oberschenkelknochen entfernt wird.
Legen Sie dann den Oberschenkelknochen in eine zuvor vorbereitete und beschriftete sechs Wellplatte gefüllt mit 0,5 Milliliter RPMI-Medien. Identifizieren Sie die Patellasehne des rechten Stützgelenks und verwenden Sie eine feine Schere, um das angrenzende Muskelgewebe proximal bis gelenkzustoßen, bis etwa fünf Milliliter Quadrizepssehne proximal zur Patella ausgesetzt sind. Schneiden Sie durch die Quadrizepssehne etwa drei bis vier Millimeter proximal zur Patella, um einen Griff zu bilden und verwenden Sie feine Zangen, um die Spannung sanft vom Gelenk wegzuziehen, um die Ränder der Gelenkkapselbefestigung freizulegen.
Beginnend mit dem Oberschenkelknochen und in Richtung der Tibia, verwenden Sie ein Skalpell vorsichtig entlang der Ränder der Gelenkkapsel auf beiden Seiten schneiden, während eine sanfte Traktion auf der Quadrizepssehne. Wenn der Synovialgewebeblock nur an der Tibia befestigt ist, sollte das intraartikuläre Fettpolster deutlich distal gegenüber der Patella sichtbar sein und kann sanft vom Gelenk und vorderen Aspekt des Minsky gelöst werden. Dann schneiden Sie entlang des verbleibenden Teils der Gelenkkapsel, um den Synovialgewebeblock zu entfernen und legen Sie ihn sofort in eine zuvor vorbereitete und beschriftete sechs Well-Platte mit 1,5 Milliliter rpMI-Medien gefüllt.
Wenn alle Gewebe gesammelt sind, legen Sie zwei gepoolte Milz pro Bedingung auf ein 70-Mikrometer-Zellsieb in einem 15-Milliliter-Rohr und verwenden Sie einen sterilen Drei-Milliliter-Spritzenkolben, um das Gewebe vorsichtig durch den Netzfilter zu massieren und das Sieb häufig mit insgesamt sechs Millilitern RPMI 1640 Medium summieren, ergänzt mit 10%FBS. Sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation, und setzen Sie das Pellet in fünf Millilitern roter Blutkörperchen Lyse Kugelfisch. Nach fünf Minuten, stoppen Sie die Reaktion mit 10 Milliliter PBS und Zentrifugieren der Zellen.
Wenn keine roten Blutkörperchen mehr beobachtet werden, setzen Sie das Pellet in einem Milliliter frischer PBS zum Zählen wieder aus. Legen Sie für die Lymphknotenverarbeitung alle vier Lymphknoten auf ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein neues 15-Milliliter-Rohr und verwenden Sie einen neuen sterilen Drei-Milliliter-Kolben, um die Lymphknoten vorsichtig durch das Netz in eine Einzelzellsuspension zu necken, dann zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500-fachem G, entsorgen Sie das Überstand und setzen Sie das Pellet in 500 Mikroliter PBS für die Zählung wieder auf. Um das Knochenmark zu isolieren, verwenden Sie eine Gewebe-Daumenzange, um den intakten Oberschenkelknochen sorgfältig zu greifen und verwenden Sie scharfe Schere, um das Ende des proximalen Oberschenkelknochens abzuschneiden.
Setzen Sie eine 23-Spur-Nadel in die Mitte der interkondylar Kerbe des Oberschenkelknochens und drehen Sie die Nadel, während Sie sanften Druck ausüben, um ein Loch in die Kerbe zu bohren. Wechseln Sie die Nadel nach Bedarf, spülen Sie den Knocheninhalt mit sechs Millilitern RPMI, ergänzt mit 10%FBS, auf ein 70-Mikrometer-Zellsieb auf einem neuen 15-Milliliter-Rohr und verwenden Sie einen neuen Drei-Milliliter-Spritzenkolben, um das Knochenmark vorsichtig durch das Netz zu drücken. Führen Sie im Folgenden den RBC-Schritt aus, wie für die Milz demonstriert.
Wenn keine roten Blutkörperchen mehr beobachtet werden, setzen Sie das Pellet in einem Milliliter frischer PBS zum Zählen wieder aus. Für die Verarbeitung des Synovials verwenden Sie eine feine chirurgische Schere, um die beiden Synovialgewebeblöcke in winzige Stücke zu würfeln und die Proben in ein neues 15-Milliliter-Rohr zu übertragen. Spülen Sie den Sammelbehälter mit 500 Mikrolitern Medium, um alle verbleibenden Zellen und Synovialgewebe zu sammeln und ziehen Sie die Wäsche in das Probenentnahmeröhrchen.
Als nächstes fügen Sie ein ausreichendes Volumen des Enzyms hinzu, um in einer Einheit pro Milliliter Endkonzentration zu erreichen und die Synovialgewebeprobe bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator für zwei Stunden eines Rotators zu verdauen. Achten Sie beim Einlegen der Rohre in den Rotator auf ausreichende Bewegung. Am Ende der Inkubation stoppen Sie die Verdauung mit acht Millilitern RPMI, ergänzt mit 10%FBS, und filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein neues 15-Milliliter-Rohr.
Spülen Sie das alte 15-Milliliter-Rohr mit fünf Millilitern Medium und verwenden Sie diese, um den Filter zu waschen. Dann sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in 500 Mikroliter PBS zum Zählen wieder auf. Um die Lebensfähigkeit der isolierten Immunzellen zu färben, fügen Sie fünfmal 10 zu den fünf Zellen jeder Zellsuspension zu den entsprechenden Brunnen von zwei verschiedenen 96 Well U-Bodenplatten hinzu und sammeln die Zellen an der Unterseite jedes Brunnens.
Fügen Sie immer genügend ungefärbte Zellen jedes Gewebetyps als Negative Kontrollen ein. Waschen Sie Zellen mit 200 Mikroliter PBS und setzen Sie die Pellets in 100 Mikroliter Zelle in permeant Amin-reaktiven Farbstoff pro Brunnen für eine 15-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt wieder auf. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal in 200 Mikroliter FACS Puffer pro Waschmittel und setzen Sie jedes Pellet in 100 Mikroliter des entsprechenden Anti-Bio-Antikörpers oder Kontrollcocktails wieder auf.
Wenn sowohl intra- als auch extrazelluläre Färbung in der gleichen durchgeführt wird, führen Sie jetzt den extrazellulären Färbungsschritt durch. Nach 30 Minuten Inkubation bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt waschen die Zellen zweimal mit 200 Mikroliter FACS Puffer pro Brunnen und setzen die Zellen und die Monozyten-Teilmengenplatte in 250 Mikroliter FACS-Puffer, ergänzt mit einem Millimolar EDTA, wieder auf. Führen Sie diesen Schritt nur, wenn keine intrazelluläre Färbung geplant ist, andernfalls gehen Sie zum intrazellulären Färbungsaspekt des Protokolls über.
Übertragen Sie dann jede Monozyten-Teilmenge in die entsprechende entsprechende FACS-Röhre auf eisgeschütztem Eis. Zur interzellulären Färbung der T-Zell-Teilmengenzellen die Pellets in 200 Mikroliter Fixationspuffer aus einem geeigneten Fixierungs- und Permeabilisierungskit für eine 40-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius, die vor Licht geschützt sind, wieder aufzuhängen. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 Mikroliter Permeabilisation Waschpuffer und setzen Sie die Pellets in 100 Mikroliter des entsprechenden Antikörpers von Interesse oder Kontrollcocktail für eine 40-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt.
Dann waschen Sie die Zellen zweimal in 200 Mikroliter Permeabilisation Waschpuffer pro Wäsche. Und die Zellen in 250 Mikroliter FACS plus EDTA-Puffer wieder aussetzen, bevor die Proben in die entsprechenden FACS-Röhren auf lichtgeschütztem Eis übertragen werden. Hier kann die hierarchische Gating-Strategie für das Monozyten-Untersatzpanel auf Immunzellen beobachtet werden, die aus dem Knochenmark von DMM-behandelten Tieren gewonnen wurden.
Ungefärbte Trolle können verwendet werden, um die wahren Negative für den toten lebenden Fleck zu bestimmen, und die Tore können jedes Mal angepasst werden, wenn das Experiment nach Bedarf durchgeführt wird. In dieser repräsentativen Analyse wurden Immunzellen sechs Wochen nach DMM- oder Scheinkontrolloperationen aus dem Synovialgewebe isoliert und mit extrazellulären Oberflächenmarkern befleckt. Ein höherer Prozentsatz der Ly-SC-positiven MHC2-Negativ- und M2-Makrophagen wird bei DMM-behandelten Tieren beobachtet als bei den Zellpopulationen, die bei Scheinchirurgie-Mäusen beobachtet wurden.
Hierkann kann die hierarchische Gating-Strategie für das extra- und intrazelluläre T-Zell-Panel auf Immunzellen beobachtet werden, die aus der Milz von DMM-behandelten Tieren isoliert sind. Ein höherer Prozentsatz der TH1-Zellen wird in den Lymphknoten und Synovialgeweben von DMM-Tieren sowie in höheren Mengen von T-Regulierungszellen und TH17-Zellen beobachtet. Um den Erwerb hochwertiger Proben zu gewährleisten, müssen die Gewebe schnell, akribisch und konsistent geerntet werden.
Sobald die Immunzellen isoliert sind, können andere nachgeschaltete Analysen wie RTPCR, Zellkultur und auf Blut ruhen, um ein Licht auf molekulare Prozesse von Interesse zu werfen.
