Ziel unserer Forschung ist es, den Zusammenhang zwischen sich ausbreitenden Depolarisationen und leichten traumatischen Hirnverletzungen anhand von Hirnmodellen zu verstehen. Unsere Gruppe und andere haben kürzlich gezeigt, dass sich ausbreitende Depolarisationen bei leichten Verletzungen des geschlossenen Schädels bei Mäusen auftreten. Häufig verwendete in vivo-Elektrophysiologie-Verstärker filtern die langsamen extrazellulären Verschiebungen heraus, die mit der Ausbreitung der Depolarisation verbunden sind, so dass es nahezu unmöglich ist, die sich ausbreitende Depolarisation zu erkennen.
Der Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass sowohl die Bildgebung als auch die In-vivo-Elektrophysiologie genutzt werden können, um das Fehlen oder Vorhandensein von sich ausbreitenden Depolarisationen nach einer leichten traumatischen Hirnverletzung zu bestätigen. Wir haben begonnen zu verstehen, welche Rolle die Ausbreitung von Depolarisationen bei akutem Verhalten, Pathologie und langfristigen kognitiven Defiziten im Zusammenhang mit MTBIs spielt. Zu Beginn legen Sie das betäubte Tier in einen stereotaktischen Rahmen und halten die Körpertemperatur des Tieres mit einem Heizkissen aufrecht.
Machen Sie mit einer Skalpellklinge der Nummer 10 einen Schnitt entlang der Mittellinie von rostral nach kaudal. Und tragen Sie sofort Cyanacrylatkleber auf den Einschnitt auf. Spreizen Sie dann die Haut seitlich, um den Schädel freizulegen.
Geben Sie ein oder zwei zusätzliche Tropfen Cyanacrylatkleber über den Schädel, um zusätzlichen Schutz zu bieten. Während der Kleber trocknet, verwenden Sie eine sterile chirurgische Schere, um die Schnittgröße über dem Kleinhirn zu erhöhen. Bohren Sie anschließend mit einem 0,8-Millimeter-Bohrer Pilotlöcher durch den Schädel und drehen Sie die Schrauben in den Schädel.
Wickeln Sie überschüssigen Draht um die Schraube und lassen Sie etwas Spielraum für die spätere Platzierung des Kopftisches. Sobald alle Schädelschrauben an Ort und Stelle sind, stecken Sie alle goldenen Stifte in den gewünschten Kopfstufenstecker. Halten Sie den Steckverbinder mit dem stereotaktischen Arm fest und positionieren Sie die Steckerstifte dicht über den Schraubenköpfen, ohne dass der Draht berührt wird.
Versiegeln Sie den gesamten Bereich mit Cyanacrylatkleber und stellen Sie sicher, dass der Bildgebungsbereich vor den Schädelschrauben ungestört bleibt. Bauen Sie Zahnzement um die Basis der Goldstifte auf und stellen Sie sicher, dass die Goldstifte von den Schädelschrauben nicht mit denen im Kopfstadium verbunden sind. Lassen Sie den Zahnzement aushärten, bevor Sie den Kopfstufenverbinder entfernen.
Schalten Sie zunächst den IOS-Computer und die LED-Panel-Platine ein. Montieren Sie das elektrodenimplantierte anästhesierte Tier in einem Aufprallbett unter der Kamera. Und stellen Sie den Fokusring so ein, dass er die kortikale Oberfläche abdeckt.
Drücken Sie nach dem Laden des intrinsischen optischen Signals oder der IOS-Einstellungen die Live-Taste, um die Maus anzuzeigen und den Schädel des Tieres unter der Kamera zu zentrieren. Drücken Sie dann Multi-D-Erfassung, um auf die Erfassungseinstellungen zuzugreifen und die gewünschten Zeitpunkte auszuwählen. Speichern Sie Bilder im angegebenen Dateipfad mit dem entsprechenden Namenspräfix.
Verbinden Sie die goldenen Stifte vom Tier mit dem Kopftischstecker und dann mit dem Kopftisch. Schalten Sie den Elektrophysiologie-Computer ein und verbinden Sie den Computer mit dem Elektrophysiologie-Gerät. Nachdem Sie die Einstellungen für die Intan-Software geladen haben, klicken Sie auf das Symbol Dateiformat auswählen und wählen Sie im Popup-Fenster One File Per Signal Type Format aus.
Wählen Sie dann im Reiter BW unter Hardwarebandbreite die Verstärkerbandbreite von 0,13 bis 500 Hertz aus. Wählen Sie unter Filteranzeigeauswahl die Option Breit aus. Nachdem Sie die Tief- und Hochpassfilter eingestellt haben, klicken Sie auf das Symbol Dateiname auswählen, um den gewünschten Dateipfad zum Speichern auszuwählen.
Schalten Sie für den Aufprall den elektromagnetischen Impaktor ein und betätigen Sie den Hebel, um zu prüfen, ob die Spitze richtig ein- und ausfährt. Legen Sie das Tier schnell auf ein Schaumstoffbett und schieben Sie das Bett unter die Spitze des Schlagkörpers. Richten Sie die Schlagkörperspitze an der Mittellinie aus und positionieren Sie sie einen Millimeter rostral des Bregmas.
Senken Sie dann die Schlagdüse ab, bis sie die Oberseite des Kopfes des Tieres fest berührt. Drücken Sie den Hebel, um die Schlagdüse zurückzuziehen, und senken Sie sie dann manuell um fünf Millimeter ab, bevor Sie den Schlaghebel aktivieren. Nehmen Sie das Tier sofort aus dem Schaumstoffbett und legen Sie es innerhalb von fünf Sekunden zur Bildgebung unter die Kamera.
Klicken Sie auf Erfassen, um das IOS-Imaging im Fenster Mehrdimensionale Erfassung zu starten. Nehmen Sie Bilder vier Minuten lang auf, um das gesamte sich ausbreitende Depolarisationsereignis aufzuzeichnen. Um die elektrophysiologische Aufzeichnung zu starten, klicken Sie auf das Aufnahmesymbol in der Intan-Software.
Ziehen Sie nach Abschluss der Aufnahme den Netzstecker des Tieres von der Kopfstufe und dem Anschluss und setzen Sie es wieder in seinen Käfig ein. Um den Bildstapel zu öffnen, klicken Sie auf Datei, gefolgt von Importieren und Bildreihenfolge. Zeichnen Sie mit dem Cursor ein Quadrat und definieren Sie den interessierenden Bereich, um das Diagramm der sich ausbreitenden Depolarisation zu erstellen.
Navigieren Sie zu Bild, gefolgt von Stapel und Z-Achsen-Profil plotten, um das Diagramm zu zeichnen, und klicken Sie auf die Schaltfläche Live. Klicken Sie im generierten Diagramm auf Liste, um eine Liste mit Werten zu generieren. Konvertieren Sie das Graustufenbild zur Visualisierung mit einer Fire-Lookup-Tabelle.
Es wurden sich ausbreitende Depolarisationen beobachtet, die sich über den Kortex und große Blutgefäße durch das Fenster ausbreiteten. Die hochfrequente Aktivität in den elektrophysiologischen Aufzeichnungen zeigte eine schnelle Rückkehr bei Scheintieren nach der Isofluranentfernung. Bei depolarisierten Tieren blieb die hochfrequente Aktivität jedoch mehrere Minuten lang unterdrückt, bevor sie sich erholte.
Die Leistungsdiagramme zeigten unter beiden Bedingungen einen deutlichen Anstieg der Leistung nach der Wiederherstellung von der Unterdrückung.
